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碱裂解法提取质粒:原理和注意
事项
质粒提取之达人建议
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的
实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年
了,几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀
学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因,我想
大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤,而没有
对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主
要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生
水平都差不多,甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不
得不让人感到悲哀了。
我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书,“学
而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的
独苗说,你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义
就是将教课书上的东西记住,考试的时候能拿高分……这
就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化
在这一点上不发生变化,那么科学是不能在中国真正扎根
的,它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学,
它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了,那我想
问有那位神仙看看书就会骑自行车了?或者听听体育老
师的讲解就会滑冰了?可是光动手不思考,不就成了一个
工匠?一个合格的生命科学研究者,需要在这两方面完善
自己。一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善
于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,
希望你看本文后能有所思考,让中国的未来有希望。
为了方便理解,这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶
液:
溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,
pH8.0;
溶液II,0.2NNaOH/1%SDS;
溶液III,3M醋酸钾/2M醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应,首先
要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的
Tris-Cl溶液,是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是
干什么的呢?说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处
只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因
此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,
几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那
么EDTA呢?大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金
属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:
抑制DNase的活性,和抑制微生物生长。在溶液I中加入
高达10mM的EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的
所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没
什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里
SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大
部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组
DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象,因为基因
组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀
了,尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2M的醋酸又是为什么而加的呢?是为了中和
NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和
之。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小
的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的
时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总
会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一
条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后
基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会,
因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都
是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的,DNA分
子的变性其实是个副产物,与它是不是沉淀下来其实没有
关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为
了PDS沉淀更充分一点。
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,
其实还有
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