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碱裂解法提取质粒：原理和注意

事项

质粒提取之达人建议

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的

实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年

了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀

学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想

大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有

对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主

要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生

水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不

得不让人感到悲哀了。

我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学

而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的

独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义

就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这

就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化

在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根

的，它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学，

它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想

问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老

师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个

工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善

自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善

于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，

希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶

液：

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，

pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先

要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的

Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是

干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处

只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因

此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，

几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那

么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金

属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：

抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入

高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的

所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没

什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里

SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大

部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组

DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因

组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀

了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和

NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和

之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小

的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的

时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总

会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一

条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后

基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，

因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都

是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分

子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有

关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为

了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，

其实还有