GBT 34750-2017 副猪嗜血杆菌检测方法.docx

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T34750—2017

副猪嗜血杆菌检测方法

Detectionmethodsforhaemophilusparasuis

2017-11-01发布2018-05-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T34750—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河北农业大学动物科技学院、山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准起草人：吴志明、闫若潜、张健、赵明军、赵雪丽、宋勤叶、徐引弟、王东方、王淑娟、安春霞、刘梅芬、张盼盼、谢彩华、高凤山、方先珍、吴家强、拜廷阳、王一、刘淑敏。

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GB/T34750—2017

副猪嗜血杆菌检测方法

1范围

本标准规定了副猪嗜血杆菌的分离与鉴定、巢式PCR检测和实时荧光PCR检测方法。

本标准适用于对猪的肺脏、心脏、脑等组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血，细菌培养物等样品中副猪嗜血杆菌的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(BasePair)

DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)

dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphates)MGB:小沟结合(MinorGrooveBinder)

NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NicotinamideAdenineDinucleotide)PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution)

PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerase)TE:Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTABuffer)

TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(TrypticSoyAgar)TSB:胰蛋白胨大豆肉汤(TrypticSoyBroth)

3仪器

3.1生物安全柜。

3.2恒温培养箱。

3.3光学显微镜。

3.4全自动微生物鉴定仪。

3.5PCR扩增仪。

3.6高速冷冻离心机(12000×g以上)。

3.7核酸电泳仪和水平电泳槽。

3.8恒温水浴锅。

3.9单道微量移液器(0.5μL~10μL;2μL～20pL;20pL～200μL;100μL～1000μL)。

3.10组织匀浆器或研钵。

3.11凝胶成像系统(或紫外投射仪)。

3.12实时荧光定量PCR仪。

4耗材

4.11.5mL无菌离心管。

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GB/T34750—2017

4.20.2mLPCR薄壁管或八联管。

5试剂

5.1TSA培养基和TSB培养基(见附录A)。

5.2NAD贮存液(见附录A),2℃~8℃条件下保存。

5.3革兰氏染色试剂：含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏(Lugol)碘液、95%乙醇和沙黄(蕃红)染液，常温条件下保存。

5.4葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管，2℃~8℃条件下保存。

5.53%过氧化氢、0.8%磺胺酸冰醋酸溶液、0.5%α-萘胺乙醇溶液、0.1%盐酸二甲基对苯二胺(见附录

A),常温条件下保存。

5.6消化液I和TE缓冲液(见附录B),常温条件下保存。

5.71×TAE核酸电泳缓冲液、酚-氯仿-异戊醇混合液(25+24+1)、0.01mol/L(pH7.2)的PBS、阿氏

液等试剂(见附录B),6×电泳上样缓冲液，75%乙醇，以上试剂2℃~8℃条件下保存。

5.8组织悬液、消化液Ⅱ(见附录B),异丙醇，DNA标准分子量，置-20℃保存。

5.9阳性对照、阴性对照(见附录B)。

5.10巢式PCR扩增用土、下游引物序列(见附录C)。

5.11副猪嗜血杆菌巢式PCR检测反应体系(见附录D)。

5.12副猪嗜血杆菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列(见附录C。

5.13副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测