GBT 35909-2018 猪肺炎支原体PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T35909—2018

猪肺炎支原体PCR检测方法

DetectionofmycoplasmahyopneumoniaeusingPCRmethod

2018-02-06发布2018-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T35909—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：邵国青、冯志新、熊祺琰、刘茂军、张磊、王海燕、武昱孜、韦艳娜、刘蓓蓓、甘源、华利忠、王佳、王丽。

1

GB/T35909—2018

猪肺炎支原体PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪肺炎支原体PCR检测的操作方法。

本标准适用于实验室对猪临床样品(猪鼻拭子、肺组织和支气管肺泡灌洗液)、细菌培养物和动物产品中猪肺炎支原体核酸的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

病死及病害动物无害化处理技术规范农医发[2017]25号

兽医实验室生物安全管理规范(中华人民共和国农业部公告第302号)

3术语和定义及缩略语

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

猪肺炎支原体Mycoplasmahyopneumoniae;MHP

支原体科支原体属(Mycoplasma)成员，是猪支原体肺炎(MPS)的主要病原体。注：猪支原体肺炎又称猪气喘病，是一种经呼吸道感染的慢性病，对养猪业造成严重危害。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

PBS磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsalinebuffer)

TAETAE电泳缓冲液(tris-acetate-ethylenediaminetetraaceticacidbuffer)TBETBE电泳缓冲液(tris-borate-ethylenediaminetetraceticacidbuffer)Taq酶TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)

dNTPs脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates)

DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)CCU颜色变化单位(colorchangeunit)

MPS猪支原体肺炎(mycoplasmalpneumoniaofswine)

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GB/T35909—2018

4仪器设备

4.1高速冷冻离心机。

4.2核酸电泳仪。

4.3恒温水浴锅。

4.4凝胶成像系统。

4.5PCR扩增仪。

4.6水平电泳槽。

4.7微量移液器(量程：0.5μL～10,2pL～20μL;20pL～200μL;100μL~1000μL)。

4.8组织匀浆器。

5试剂和材料

5.1引物

上游引物：5-CAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA3

下游引物：5-TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC8

5.2猪肺炎支原体阳性对照样品及阴性对照样品

以灭活前浓度为1×10CCU/mL～10CCU/mL的猪肺炎支原体菌液培养物(由指定单位提供),经PCR检测不含猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻发原体后作为阳性对照样品，以无菌双蒸水作为阴性对照样品。

5.3试剂

5.3.1除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

5.3.2Taq酶。

5.3.3PCR反应缓冲液(与Taq酶匹