GBT 34757-2017 猪流行性腹泻 病毒RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T34757—2017

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

Porcineepidemicdiarrhea—RT-PCRfordetectingvirusacid

2017-11-01发布2018-05-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T34757—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、河南牧业经济学院、河南农业大学。

本标准主要起草人：李一经、邵卫星、魏荣、宋建德、姜艳平、袁丽萍、唐丽杰、乔薪瑗、崔文、徐耀辉、吴发兴、张志、孙映雪、魏战勇、李晓成。

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GB/T34757—2017

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的仪器、试剂、样品的采集和处理、RT-PCR程序、电泳及结果判定的技术要求。

本标准适用于快速检测猪临床样品(猪小肠和新鲜粪便)或细胞培养物中猪流行性腹泻病毒核酸。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AMV:鸟类RNA病毒反转录酶(avianmyeloblastosisvirus)bp:碱基对(basepair)

DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

dNTPs:4种脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleosidetriphosphates)

PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsalinebuffer)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction)RRI:RNA酶抑制剂(rnaseribonucleaseinhibitor)

Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)

4仪器

4.1PCR扩增仪。

4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

4.3组织研磨器或者研钵。

4.4冰箱2℃~8℃冰箱和一70℃以下超低温冰箱。

4.5核酸电泳仪和水平电泳槽。

4.6微量移液器量程分别0.2μL~2μL、1μL~10μL、10pL~100pL、20μL~200μL和100μL~1000μL的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。

4.7高压灭菌锅。

4.8凝胶成像系统(或紫外透射仪)。

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GB/T34757—2017

5耗材

5.11.5mL无RNA酶离心管。

5.20.2mLPCR管。

6试剂

除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器进行分装。

6.1水，GB/T6682,三级水。

6.2病毒裂解液：商品化RNA提取试剂盒，4℃~8℃保存。

6.3氯仿：常温保存

6.4异丙醇：使用前预冷至-20℃。

6.5无水乙醇；-20℃预冷。

6.675%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

6.7AMV逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液：-20℃保存，避免反复冻融。

6.8DEPC水：购买商品化DEPC水。

6.9Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液一20Q保存，避免反复冻融。

6.10RRI:-20℃保存，避免反复冻融。

6.11dNTPs:含dATPdGTP,dCTP、dTTP各10mmol,-20℃保存，避免反复冻融。

6.12DNA分子量标准：DL2000bp