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第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛

作品名称：喜树根器官培养和抗癌物质喜树碱生成的研究

申报者姓名

（集体名称）：袁月姗刘梓璇

类别：

√自然科学类学术论文

□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文

□科技发明制作A类

□科技发明制作B类

报送方式：

√省级报送作品

□高校直送作品

喜树根器官培养和抗癌物质喜树碱生成的研究

袁月姗刘梓璇

指导老师：吴鸿（教授）杨跃生（教授）

摘要:我国特有树种喜树产生的喜树碱是一种具有抗癌活性的物质,利用生物技术将有可能解决喜树资源匮乏的问题,生产出更多的喜树碱应用于临床治疗。本研究以离体根器官为材料,采用了固体和液体悬浮培养方法对喜树根在离体条件下的生长状况和特点进行了探讨。在此基础上,通过组织化学技术和薄层色谱技术（TLC）对离体培养的根中的喜树碱进行了定性和定量分析。实验结果表明,离体培养的根器官不仅具有生成喜树碱的能力,而且其能力还可能强于非离体的根。同时,试验还发现喜树离体根能够很好地适应液体培养的环境条件。离体根具有很好的对液体培养的适应性以及更强的合成喜树碱的能力是进行根培养工业化生产的非常有利的内因条件。这些研究结果为应用生物技术大量培养离体根生产喜树碱提供了重要的依据。

关键词:喜树根器官培养喜树碱TLC含量测定

喜树（CamptothecaacuminataDecne）为珙桐科（Nyssaceae）植物,我国南方特有树种。1966年,美国的Wall等人从喜树茎的提取物中分离得到了抗癌活性物质,将其命名为喜树碱（Comptothecin,CPT）。1985年,Hisang等人发现喜树碱作为一种拓扑异构酶Ⅰ（TopoⅠ）的抑制剂具有抗癌活性,因而为喜树碱的进一步临床应用提供了理论基础。经临床试验证明,喜树碱对30余种肿瘤均有明显疗效,且毒副作用小,具有极高的临床应用价值（崔岚等,1999）。

由于长期以来过度采伐自然环境的破坏以及人工培育技术滞后等原因,目前的喜树资源十分有限。1999年8月经批准,喜树被列为第一批国家重点保护野生植物,保护级别为Ⅱ级。喜树以种子繁殖为主,但其种子发芽率低,加之扦插繁殖困难,在一定程度上限制了喜树资源的开发利用（张启香等,2024）。虽然目前利用植物组织培养方法已可获得喜树种苗（吕立堂等,2003；陈颖等,2004）,然而,由于栽培周期过长及土地资源的日益紧缺,传统栽培方式在提供喜树原材料方面存在着难以解决的问题。因此,近年来用生物技术的方式生成喜树碱的工作得到了国内外研究人员的重视（张冬艳等,2002；邓冬青等,2004；Lorence等,2004；郭勇等,2024）。

本研究采用喜树的根为离体培养的材料,并利用仪器和组织化学分析方法对根在离体培养条件下的喜树碱生成情况进行试验分析,旨在探讨离体根对培养条件的要求以及了解离体根器官的喜树碱合成能力,为应用生物技术生产喜树碱提供理论依据和技术资料。

材料与方法

材料

原始材料采自大学校园内约20年树龄的喜树。于九月份从树上采集果实,剥取种子。先用洗涤剂与清水间隔冲洗各三次,再用79%乙醇泡洗三十秒,最后用07%次氯酸钠溶液对种子进行10分钟的表面灭菌。灭菌后用无菌水漂洗三次,在无菌操作台中将种壳和种皮剥去,取幼胚作为培养的出发材料。

12方法

121植物组织培养

幼胚萌发培养：采用不添加激素的MS琼脂培养基,每个培养基接种3个幼胚。

增殖培养：以幼胚萌发培养基为基础,添加蔗糖2%和BA10mg/L,将萌发生长的小苗从茎上切开成带侧芽的小段,每段作为一个外植体,接种到培养基上。

生根培养：将带有4到5片幼叶的无根幼茎接种到含有2%蔗糖的大量无机元素减半的MS琼脂培养基上培养,诱导不定根产生。

根器官琼脂培养基培养：采用大量无机元素减半的B5培养基配方,添加蔗糖2%,IBA05mg/L,酵母浸出物800mg/L。从以上生根培养中得到的小苗上切取幼根作为培养材料。

根器官液体悬浮培养：培养基成分和根器官的琼脂培养基相同,但不添加琼脂。

以上各种培养,除了幼胚的萌发培养早期(7d)在黑暗的条件下进行外,都在光照条件下进行。每天光照12小时；光照x。温度为（25±2）℃；

122荧光显微法观察植株中喜树碱的分布

在培养结束后对生长情况相似的3个样品进行徒手切片,以标准品溶液抹片为正对照,在紫外光显微镜下观察有无喜树碱的生成（喜树碱在紫外光下发蓝绿色荧光）以及喜树碱分布的部位。为进一步分析观察所得荧光是否属于喜树碱,将一幼根做成压片后观察荧光情况,照相；然后对其进行乙醇处理12小时以溶