DB12T 1328-2024 畜禽养殖粪污中典型致病菌检测 三重PCR法.docx

ICS65.020.30CCSB43

ICS

65.020.30

CCS

B43

天 津 市 地 方 标 准

DB12/T1328—2024

畜禽养殖粪污中典型致病菌检测三重数字PCR法

Detectionoftypicalpathogenicbacteriainlivestockwaste—TripledigitalPCRmethod

2024-07-01发布 2024-09-01实施

天津市市场监督管理委员会 发布

DB12/T1328

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前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、天津市动物疫病预防控制中心、新疆农垦科学院、天津市农业科学院。

本文件主要起草人：杜连柱、程深伟、张克强、梁雨、王健春、尹春博、刘福元、郜兴亮、杨井泉、苏蘩。

DB12/T1328

DB12/T1328—2024

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畜禽养殖粪污中典型致病菌检测三重数字PCR法

范围

本文件规定了畜禽养殖粪污中典型致病菌的三重数字PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器设备、操作步骤、结果分析与表述及生物安全措施。

本文件适用于天津市畜禽养殖粪污中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌的快速定量检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008实验室生物安全通用要求

GB/T25171—2023畜禽养殖环境与废弃物管理术语

GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27522—2023畜禽养殖污水监测技术规范

SN/T4853转基因大米定量检测数字PCR法

SN/T5334.1—2020转基因植物产品的数字PCR检测方法第1部分：通用要求与定义

术语和定义

GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的术语和定义适用于本文件。

原理

微滴式数字PCR系统采用毛细通道网格将数万个微滴离散进入2D芯片，从而有效地实现反应体系的精准分割。该系统利用金黄色葡萄球菌的nuc、大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE以及沙门氏菌的FimY特异性基因序列对畜禽养殖粪污中典型致病菌进行检测。在PCR扩增后，通过泊松分布校正阳性微滴的数量和比例，可以准确计算靶基因序列的起始拷贝数或浓度，从而同时实现对三种病原体的快速定量检测。

仪器和设备

所需仪器和设备如下：a）微滴生成系统；b）PCR仪；

微滴阅读分析系统；

高速冷冻离心机：控温4℃?8℃，离心力不小于12000g/min；e）分析天平：精度0.01g；

f）恒温水浴箱：95℃±1℃；g）湿热高压蒸汽灭菌器；

h）恒温振荡摇床：控温28℃±1℃?37℃±1℃，转速在125r/min?250r/min；i）生物安全柜；

j）组织研磨仪；

k）冰箱：控温0℃?4℃；

l）超低温冰箱：控温-20℃?-80℃；

m）微量移液器：0.5μL?10μL，20μL?200μL，100μL?1000μL；n）超微量紫外分光光度计；

o）无菌离心管：1.5mL，15mL，50mL。

试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682—2008规定的一级水。

所需试剂和材料如下：

5×dPCR预混液；

溶菌酶；

裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl调至pH8.0；

无水乙醇；

异丙醇；

DNAoff防核酸污染用剂；

荧光素钠盐。

引物和探针

金黄色葡萄球菌nuc基因引物和探针

nuc上游引物：5’-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’

nuc下游引物：5’-CTTTAGCCAAG