NYT 2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2417—2013

副猪嗜血杆菌PCR检测方法

Polymerasechainreaction(PCR)fordetectionof

Haemophilusparasuis

2013-09-10发布2014-01-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T2417—2013

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。

本标准主要起草人：逯忠新、贺英、储岳峰、赵萍、高鹏程。

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NY/T2417—2013

副猪嗜血杆菌PCR检测方法

1范围

本标准规定了检测副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)的聚合酶链式反应(Polymerase

chainreaction,PCR)技术。

本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测。

2材料准备

2.1器材

PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLPCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。

2.2试剂

NET缓冲液(配制方法参见A.1)、TAE电泳缓冲液(配制方法参见A.2)、RNaseA酶、蛋白酶K、TagDNA聚合酶(5U/pμL)、10×PCR缓冲液(含Mg2+)、脱氧三磷酸核苷酸混合液(dNTPs,各2.5mmol/μL)、125bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚—氯仿一异戊醇(25:24:1)、三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠(Na?EDTA)、冰醋酸、氯化钠、溴酚蓝、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠(SDS)、灭菌超纯水。

2.3引物

引物序列：F1:5’-TATCGGGAGATGAAAGAC-3’;F2:5’-GTAATGTCTAAGGACTAG-3;Revx:5’-CCTCGCGGCTTCGTC-3’。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20μmol/L。靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。

2.4样品采集

2.4.1气管分泌物

用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物，放入无菌试管中。

2.4.2肺脏

无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。

2.4.3关节液

若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘酊消毒，用2mL或5mL灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL~

2mL关节渗出液。

2.4.4采集的样品

应在4℃条件下立即送到实验室。

2.5DNA提取

2.5.1样品处理

2.5.1.1气管分泌物拭子

将每支拭子浸入1mL～2mLNET缓冲液中30min,反复挤压。将浸出液经4℃7500g离心

15min后，弃上清。收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。

2.5.1.2肺组织

将肺组织样品剪碎，按1g加入0.9mLNET缓冲液研磨后，用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于

2mL灭菌离心管，4℃7500g离心15min,弃上清。收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。

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2.5.1.3关节液

将500μL关节液和500μLNET缓冲液等体积混匀后，4℃7500g离心20min,弃上清，收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。

2.5.2DNA的提取方法

2.5.2.1取2.5.1中制备的样品悬液500μL,加入100μL20%的SDS(终浓度3.4%),混匀。在95℃~100℃孵育10min后，迅速放置于冰上冷却10min～15min。

2.5.2.2在样品中加入RNaseA至终浓度为40pg/mL,50℃水浴30min。然后，加入蛋白酶K至终浓度为200μg/mL,50℃水浴30min。

2.5.2.3加入等体积的酚—氯仿一异戊醇(25:24:1),手颠倒摇匀2次～3次，4℃9000g离心

10min。

2.5.2.4转移上清液于另一离心管中。

2.5.2.5重复2.5.2.3、2.5.2.4操作过程，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，手颠倒摇匀2次～3次，—2