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胶内酶解质谱样品前处理-蛋白考染胶

溶液配制：

1、水：HPLC级；乙腈：HPLC级；乙醇：HPLC级；

2、200mMNH4HCO3溶液：取NHHCO加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50mMNH4HCO3

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溶液，稀释8倍得到25mMNH4HCO3溶液；

3、25mMNH4HCO3的50%的乙醇-水溶液（考染脱色液）：50%乙醇-水溶液和50mMNH4HCO3

溶液等比例混匀；

4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液；

5、DTT溶液：10mMDTT的25mMNH4HCO3溶液（ml，现配此浓度，-20℃保存须两天内用

完）；

6、IAA溶液：55mMIAA的25mMNH4HCO3溶液（mg/ml，现配此浓度，避光保存，-20℃

保存须两天内用完）；

7、Trypsin溶液：取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液（浓度为100ng/ul（20ug到200ul），

溶于50mMNH4HCO3溶液中）,用50mMNH4HCO3溶液稀释为10ng/ul，全程冰上操作；

8、50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）；

9、75%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）；

10、%三氟乙酸-水溶液；

11、50%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）。

12、避光新鲜配置脱色液(银染)：50mMNaS2O3:15mMK3Fe(CN)=1：1混合

取胶

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1.用超纯水清洗胶块2次，用手术刀片切下胶上目标条带，用手术刀片充分切碎(1mm

大小，用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。

第一天：

考马斯亮蓝染色凝胶的脱色

2.把切碎的胶块置于管中（预先加入1ml考染脱色液，含25mMNH4HCO3的50%的乙醇-

水溶液），室温震荡15-20min（在混匀仪中高速震荡混匀），重复2-3次，直至胶块

无色，14000rpm离心1min,去上清。

3.加入1ml10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次，每次30

分钟，去上清。

4.加入1ml水，在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次，每次5-10分钟，去上

清。

5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓

缩功能，下同）。

Destain银染凝胶的脱色

1.加500μl脱色液，室温避光震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复1～

2次至胶块去除银染颜色。

2.加500μl50mMNH4HCO3，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复

1～2次至溶液无明显黄色。再加500μl50%乙腈，震荡5～10min，14000rpm

离心1min，弃去溶液。

3.加500μl50mMNH4HCO3，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。再加

1ml50%乙腈，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，至胶块呈白色。

5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓

缩功能，下同）。

还原烷基化

5.加入30-60ul(可适当多加，没过胶条)DTT溶液，56℃恒温混匀仪上震荡孵化1

小时，冷却至室温，离心去上清，真空抽干10min。

6.加入30-60ulIAA溶液(体积与DTT大体相同)，暗处室温孵育45min，去上清。

7.加1ml50mMNHHCO溶液震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。

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8.加1ml水震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。

9.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，14000rpm离心1min,去上清，真空抽干10min。

酶解

10.把胶粒转移至的离心管中，加入25～35ulTrypsin