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碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定

1.实验原理

可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复

制的核酸分子叫载体（vector）。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相

比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工

合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使

分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些

用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录

外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致

应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性

内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和

pBluescript（简称pBS）等。

为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expressionvector)。pET系统是有史以来在大

肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。如表达载体

pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列

（lacI）、His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复

制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。pET表达系统中的受体菌为能够产生

T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。

碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染

色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。我们购买的质粒提取试剂盒的原理

也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

2.实验用品

（1）材料

含质粒载体pET-28a(+)的大肠杆菌（Novagen,Germany），以甘油菌形式-20℃

冰箱保存。

（2）试剂

1)天根生化科技有限公司的质粒提取试剂盒DP103，含RnaseA、平衡溶液BL、溶液

P1、溶液P2、溶液P3、去蛋白液PD、漂洗液PW、洗脱缓冲液EB、吸附柱CP3、

收集管等

2)10×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，

定容至1000mL；

3)6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液；

4)EB溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹。

5)琼脂糖

（3）仪器

超净工作台、恒温振荡仪、高压灭菌锅、pH计、高速离心机、移液枪、水平电泳

仪、电泳仪电源、紫外透射仪、电炉、涡旋仪。

3.实验步骤

（1）大肠杆菌培养

用接种环蘸取超低温保存的质粒载体pET-28a(+)的大肠杆菌甘油菌，在LB平板（含

50µg/mL卡那霉素Kan）上表面划线，37℃倒置培养24小时。挑取新活化的单菌落，接种

于5mlLB（含50µg/mLKan）液体培养基中，37℃振荡培养12小时左右至对数生长。菌液

以1：50比例接种于100mlLB（含50µg/mLKan）液体培养基中，37℃振荡，180-200r/min，

培养3-4h使之进入对数生长期，至OD600=0.6左右。

（2）质粒DNA的提取

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µL的平衡液BL，

12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取2mlL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1