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检验医学专业实验IV临床生物

化学检验部分(同名44567)

自动生化分析仪实际K值测定

实际K值：理论K值受样品和试剂的加量准确

度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。ε在

波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用

户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为~。

一、340nm波长实际K值测定

【实验原理】：通过有NAD+（NADP+）参与的

反应途径，用NADH或NADPH标准液来校正

仪器。用己糖激酶（HK）方法测定葡萄糖时，

葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。

葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH

的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。在需要校正

的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数，

计算出实际K值。

【注意事项】

1．减少偶然误差重复测定10次，当CV5％

时，则重新测定10次。

2．减少系统误差使用实际K值计算酶活性。

3．如果实际ε值与理论ε值偏差过大，需对仪

器检修和校正。

二、405nm波长实际K值测定

【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色

酮酸+NADH+H+

在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时

NAD+还原为NADH。因NADH在340nm处有

吸收峰，反应会引起340nm吸光度的增高。吸

光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。

NADH正向反应的最适pH偏碱性，可使反应平

衡偏向产生丙酮酸的方向。

【参考范围】成人血清LD：109U/L~245U/L

【临床意义】

1.LD活性增高：目前临床测定LD活性常用于

心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。

2.LD活性降低：目前没有发现重要的临床意义。

3.LD的特异性差，几乎存在各种组织中，如：

心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时

均致此酶增高。

【注意事项】

1.LD活性测定可用抗凝血浆，肝素的影响不大，

而草酸盐抗凝剂、EDTA都是LD的竞争性抑制

剂，能抑制LD活性。

2.不同的LD同工酶对温度的敏感性有差异。组

织提取液若放于-20℃过夜，LD4和LD5会丧失

全部的活性。

3.严禁使用溶血标本，红细胞、血小板中含有

大量的LD。

4.比色应在5~15min内完成，否则吸光值会降

低。

【评价】

LD能可逆地催化乳酸（lactate,L）和丙酮酸

（pyruvate,P）之间的氧化还原反应。

1.正向反应最适pH是8.8~9.8，能使平衡偏向

生成丙酮酸的方向。

其优点是乳酸和NAD+稳定性好。且NAD+纯品

价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反

应线性较宽,重复性较好，特异性高。

缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。

2.逆向反应的最适pH为7.4~7.8，与生理性pH

相同。

其显著的优点是NADH用量少，仅为正向反应

的3%，且反应速度比正向快3倍，灵敏度高。

缺点是但丙酮酸与NADH的稳定性较差，过量

的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。

二、连续监测法测定血清ALT

【实验原理】

L-丙氨酸+α-酮戊二酸（ALT）→α-丙酮

酸+L-谷氨酸

α-丙酮酸+NADH（LD）→乳酸+NAD+

在340nm处连续监测到NADH的消耗量，从而

计算出ALT活性浓度。

在双试剂测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二

酸的底物溶液混合，37℃保温5min，将样品中

所含的α-酮酸（如丙酮酸）消耗完，然后加入

α-酮戊二酸启动ALT