生物化学与分子生物学-3第十章第一节-有机磷农药.ppt

（4）抑制剂及其溶液宜妥为处置，严格防止污染器材及其他试剂。实验完毕后，所有器材需经肥皂水洗刷，用重铬酸钾硫酸清洗侵泡，清水洗净，蒸馏水淋洗3次，以除去残留抑制剂。（三）气相色谱-质谱联用法测定尿中二烷基磷酸酯1.原理：尿中加入磷酸二丁酯内标溶液，用HCl酸化后，采用活性炭固相萃取柱萃取有机磷代谢产物（DMP、DMTP、DMDTP、DEP、DETP、DEDTP），用五氟苄基溴衍生化，衍生产物用气相色谱-质谱法分析，内标工作曲线定量。（SH）2.样品处理和测定加内标：取2.00mL尿样，加磷酸二丁酯内标液。净化：加50μL3mol/LHCl酸化，漩涡混匀后固相萃取。N2吹干，HCl清洗，吹干后用乙腈洗脱，洗脱液转移至含25mgK2CO3试管中，蒸发至干。盐酸作用：酸性条件萃取效果好衍生化：加1.00mL乙腈（含20mgK2CO3和50μL五氟苄基溴）混匀后60℃预热恒温箱中衍生化4h，室温下测定或按下述步骤保存备测。K2CO3作用：衍生反应的催化剂干燥剂，同时还起到控制衍生酸碱度的作用保存：衍生化产物中加125μL甲苯，N2流下浓缩至75μL，-18℃冷藏备测。3.仪器参考条件色谱柱：5%二苯基-95%亚芳基二甲基聚硅氧烷色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）非极性。进样口温度：250℃。柱升温程序：初始温度90℃，保持1min，再以4℃/min升至150℃，然后以50℃/min升至270℃，保持5min。载气流速：1.20mL/min。高压不分流模式进样进样量：1μL**7μmol乙酰胆碱对应的吸光值**方法：滴定法、酸度法、分光光度法（常用）三氯化铁分光光度法和DTNB（巯基显色剂）光度法：五、全血胆碱酯酶活性的测定三氯化铁分光光度法参考全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法：羟胺三氯化铁法。《中华人民共和国卫生行业标准》（WS/T66-1996）。优点：重现性好，准确度高，设备简单；操作繁琐，保温时间长，显色产物不稳定。DTNB分光光度法参考全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法：硫代乙酰胆碱－联硫代双硝基苯甲酸法。《中华人民共和国卫生行业标准》WS/T67-1996；优点：简单、快速、灵敏（一）三氯化铁分光光度法原理水解：血液胆碱酯酶使乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。配合反应：未水解的乙酰胆碱与碱性羟胺作用，生成乙酰羟胺，乙酰羟胺在酸性环境中与三氯化铁反应生成红棕色羟肟酸铁配合物，其颜色深浅与剩余乙酰胆碱的量成正比测定：波长520nm比色定量，得出未被水解的乙酰胆碱的量，间接测出胆碱酯酶活性。乙酰羟胺胆碱胆碱羟肟酸铁配合物2.样品处理和测定2.1标准曲线的绘制pH7.20PBS配制0～7.00μmol乙酰胆碱标准系列（不需酶促水解反应）各管加碱性羟胺溶液4.0mL，振摇2min各管加4mol/L盐酸2mL，振摇1min。各管加10％FeCl3溶液2mL，摇匀，过滤以标准管零管为参比，用分光光度计测A520、绘制乙酰胆碱标准曲线。（1+2）HCl、100g/LFeCl3各2mL摇匀，过滤△A520A和B两管分别发生了什么反应？其吸光度值含义？Aa：未被水解的乙酰胆碱量对应的吸光度值Ab：加入乙酰胆碱总量对应的吸光度值2.2样品操作步骤abPBS0.98mL+耳垂血20mL37℃水浴预热5~10min+1.0mL7M乙酰胆碱标准应用液，37±0.5℃水浴准确反应30mina+碱性羟胺4.0mL振摇3min，终止反应b+碱性羟胺4.0mL振摇3min+1.0mL乙酰胆碱标准△A(酶水解乙酰胆碱吸光度)＝Ab－Aa，以△A查乙酰胆碱标准曲线得相应的被水解乙酰胆碱量(μmol)。胆碱酯酶活性绝对值（C，μmol）：酶水解乙酰胆碱量对应为0.02mL血经37℃、30min反应条件下的胆碱酯酶活性绝对值(C)。全血液胆碱酯酶活性值(μmol/ml)＝C/0.02（37℃、30min）3.羟胺三氯化铁法：WS/T66-1996方法采样和保存用血色素吸管取耳垂血20μL，注入比色管中（事先加入0.98mLPBS),立即进行测定。如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入试管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。于保温瓶中加冰运送，置4℃冰箱中可保存1周。样品测定样品管对照管标准管空白管PBS，mL0.980.981.01.0全血mL0.020.02--置37℃水浴中预热5min乙酰胆碱应用液mL1.0-