CCK8测试药物对细胞的凋亡和生长抑制作用.doc

CCK-8

实验设计：

中心的60孔为试验孔，周围的36孔要加入高压水或者培液（作为调零孔）。

每孔可建立200ul的体系（100ul的细胞液、100ul的药液—用培液稀释的），最好做到每well加入DMSO的量是一致的，con组也要加入等量的DMSO。

布局浓度梯度时，最好是浓度从低到高或者浓度中间高两端低。

2，细胞计数：记为C个/ml

3，药物准备：

⑴、假设药物储存浓度为50mM，需要设计9个浓度梯度，从50nM开始。每个浓度要设三个复孔。因为把50mM的药稀释到50nM时，取原液的量太少，误差会加大，所以先把50mM的药用DMSO稀释成50uM。1ul的50mM储存液

1:1000稀释999ul的DMSO

⑵、因每个浓度都有三个复孔，所以300ul的药液，但防止损失，就按400ul来配制。

⑶、首先计算最高浓度所需要的体积，400ul该浓度需要的量，另外400ul用于对倍稀释，所以要陪800ul。因为总体系是200ul，其中只有100ul的药液，所以浓度被稀释了，要达到终浓度为50nM，那么需要配100nM的药液。

⑷、800ul*100nM=X*50uM

X=1.6ul

⑸、在9号管里加入1.6ul的50uM的药物储存液，再加入798.4ul的培液

1-8号管分别加入400ul的培液，然后从8开始対倍稀释。

⑹、稀释好药液后，把EP管的顺序颠倒过来，方便按从低到高的浓度加入药物。

4，细胞的准备：

一般在96孔板里，每孔接种1x10E4个细胞。共需要接种30个孔，那么按40个孔来计算：

所需要的细胞原液的体积=40*10E4/浓度C=Vml

细胞液的总体积=40*100ul=4mlVml细胞原液

4ml体系(4-V)ml培液

5，具体操作：

每孔加入100ul的细胞液，再加入100ul对应浓度的药液，最后在周围的35个孔里加入高压水，1个孔加入200ul的培液（调零）。十字交叉混匀，放入温箱培养48小时。

6,加CCK-8:

48小时后,每孔加入10ul的CCK-8。温箱培养4小时后，在酶标仪检测450nm的OD值。

CCK8具体实例（检测082对Kasumi-1的生长的影响）

1.药物准备：

⑴、现有082的20mM储存浓度，先配成2mM的浓度。

20mM*x=2mM*200ulx=20ul

(2)、设计10个浓度梯度

4uM、2uM、1uM、0.5uM、0.25uM、0.125uM、0.0625uM、0.03125uM、0.0156uM、0.0078uM每个浓度设三个复孔。

（3）、因每个浓度都有四个复孔，所以需300ul的药液，但防止损失，就按400ul来配制。

（4）、首先计算最高浓度所需要的体积，400ul该浓度需要的量，另外400ul用于对倍稀释，所以要陪800ul。因为总体系是200ul，其中只有100ul的药液，所以浓度被稀释了，要达到终浓度为4uM，那么需要配8uM的药液。

⑷、800ul*8uM=X*2mMX=3.2ul

⑸、在1号管里加入3.2ul的2mM的药，再加入796.8ul的培液

2-10号管分别加入400ul的培液，然后从2开始対倍稀释。

⑹、稀释好药液后，把EP管的顺序颠倒过来，从低到高（从10到1管）的浓度加入药物。

2，细胞的准备：

细胞计数：2.7X105，（共需要接种33个孔，一般按44个孔来计算）

由于kasumi-1细胞适合高密度生长，所以，就没有稀释，按此浓度直接加100ul/well与96孔板。

3，具体操作：

每孔加入100ul的细胞液，再加入100ul对应浓度的药液，最后在周围的35个孔里加入高压水，1个孔加入100ul的细胞，100ul培液用于调零（注意调零孔不加CCK-8）。十字交叉混匀，放入温箱培养48小时。