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PCR引物设计原则

引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。

引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。

碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发.

引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构.

引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T.

6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二级结构的可能。

如何设计引物

不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。

引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。

PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计软件

PrimerPremier5.0（自动搜索）*

vOligo6（引物评价）

vVectorNTISuit

vDNAsis

vOmiga

vDNAstar

vPrimer3（在线服务）

PCR常见问题

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带。

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。