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CD19-CAR-T细胞制备工艺
CD19-CAR-T细胞制备工艺
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CD19-CAR-T细胞制备工艺
CD19-CAR-T细胞制备工艺规程
目的：制备符合规定、合格的CD19-CAR-T细胞
范围：
职责：
技术人：负责按本工艺规程进行细胞制备
实验室主管：负责本工艺规程的执行。
质量部：负责细胞制备全过程的监督和管理。
内容：
产品名称、剂型、规格：
产品名称：CD19-CAR-T
产品剂型：
规格：100mL
性状：液体
存储条件及效期：
内包装：
产品的质量标准：详见《XXX细胞质量标准》
仪器、设备一览表：
序号
仪器设备
性能要求
序号
仪器设备
性能要求
1
洁净工作台/生物安全柜
A级
8
条码打印机
2
二氧化碳培养箱
9
医用40C冰箱
3
普通离心机
10
超低温冰箱
4
掌上离心机
11
热合机
5
倒置显微镜
12
水浴锅
6
可调式移液器（移液枪）
13
细胞计数仪
7
电动辅助移液器
14
试剂一览表：
序号
试剂名称
规格
1
细胞培养基
1L/瓶
2
细胞因子A
1ug/uL
3
细胞因子B
106IU/mL
4
淋巴细胞分离液
500mL/瓶
6
转染增效剂
8ug/mL
7
生理盐水
500mL/瓶
8
CD19-CAR-T慢病毒上清
10mL/支
耗材一览表：
序号
耗材
规格
1
细胞培养板
24孔板
6孔板
2
细胞培养瓶
T25
T75
T175
3
培养袋
2L/个
4
离心管
15mL
50mL
250mL
5
移液管
5mL
10mL
25mL
6
细胞滤网
100目/个
7
输液袋
100mL
8
巴氏吸管
3mL/5mL
9
EP管
1.5mL
试剂的配制：
培养基：将1支106IU的细胞因子B溶于1L培养基，配成完全培养基1。取40mL完全培养基1，加入2uL细胞因子A，配成完全培养基2。
细胞制备工序要求：
工序
操作间
洁净级别
设备名称
洁净级别
细胞制备
制备室
C级
洁净工作台/生物安全柜
A级
细胞培养
培养室
C级
CO2培养箱
C级
细胞收集
制备室
C级
洁净工作台/生物安全柜
A级
细胞制备流程图
细胞制备：
第0天：
第0天
外周血交接
技术员检查：
存放血液的容器是否完好并密封；
标识是否清晰完整并正确；
血液是否结块，是否有溶血；
血液量是否与标识一致。
检查确认合格后，填写《标本采集交接记录》，双人签名确认。
接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制备区。
制备前准备
淋巴细胞分离液和培养基恢复至室温。
准备好若干50mL离心管和24孔培养板。
单个核细胞的分离提取
取出500uL全血置于一干净的1.5mLEP管中，用于血液三分类和流式检测。
将外周血用生理盐水按1:1体积比稀释。
加入15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管管底，用25mL移液管将35mL血细胞小心缓慢铺在淋巴细胞分离液上（电动移液器吹液速度为零）。
1800rpm,20min常温离心，离心机升6降3。
小心移去生理盐水层，吸取白膜层至50mL离心管，补加生理盐水至离心管满体积,500g，5min常温离心。
倒去上清，加入生理盐水,重悬细胞，常温离心。洗2-3遍。
用完全培养基2重悬细胞，计数。
T细胞
重悬和诱导活化
按3×106个细胞/mL/well铺在24孔板上。
将24孔置于二氧化碳培养箱中（37℃，5%二氧化碳）培养。
清场
将被血液污染的耗材弃置在生物安全垃圾袋中。
完全培养基1和2配制完后4度保存。
注意事项
第1天（细胞培养24小时）：
第1天
带CD19-CAR慢病毒上清转染T细胞
1、将24孔板的细胞收集，用生理盐水洗涤两次，500g,5min常温离心。
2、用带CD19-CAR慢病毒上清重悬细胞，计数，并用病毒上清稀释至终浓度3×106个细胞/mL，加入总体积千分之一体积的转染增效剂。
3、1000g，离心，2h。
4、在二氧化碳培养箱培养8小时后每个24孔板的孔补加500uL完全培养基1。
注意事项
第3天（转瓶、补液）
第3天
转瓶、补液
1、将24孔板的细胞转入T75的细胞培养瓶，并补充等倍体积的完全培养基1进T75的细胞培养瓶。
注意事项
第5天（转袋、补液）：
第5天
CD19-CAR-T细胞转袋补液
补充完全培养基1至400mL后，转入2L的培养袋中继续培养。
注意事项
转袋后间隔1天摊开手掌轻压一下培养袋，以推散细胞聚集。
注意事项
操作完，及时清场，并做好相关记录以及细胞制备档案填写。
清场
1、
第10天（收获细胞）
第10天
收获细胞
1、将2L培养袋的细胞培养液分装至225mL的离心管中，500g,5min。
2、将细胞用生理盐水洗两次，并用100mL生理盐水重悬。
3、
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