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单细胞RNA测序的样本制备指南

在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制备

单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和建

议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10xGenomics

的Chromium?SingleCell3’Solution不过也同样适用于其，

他方案。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的

工具，让研究人员能够揭开复杂的生物学系统，分析各个细

胞的基因表达动态，从而深入了解疾病发展过程中的细胞进

程。在此之前，分析混合细胞群体的基因表达一直是一项困

难的任务。

当然，在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制

备单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和

建议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x

Genomics的Chromium?SingleCell3’Solution，不过也同

样适用于其他方案。

了解您的样本样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论

采用哪种方案，您都必须要确保上样的细胞是有活力的，并

且完全解离成单细胞。无论是细胞系还是组织，优化细胞解

离的操作都是必不可少的，这样才能避免细胞死亡和裂解。

死细胞会裂解，释放出RNA。这种游离RNA会增加背景噪

音，影响单细胞数据的质量。

目前有不少现成的样本制备方案，但也许需要针对您的样本

类型来修改。比如，悬浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分

选的细胞已经呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。不过，

如果样本换成了组织，那就有必要精心优化解离操作，以确

保数据质量最高。

另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相

距甚远，而准确测定此参数将影响一些关键决定，比如文库

制备过程中的PCR循环数。举个例子，人外周血单核细胞

（PBMC）的RNA含量极低，只有0.75pg/细胞，而HCC38

细胞系则富含RNA，含量达到21.6pg/细胞。

处理也要小心移液相信大家都对自己的移液技术充满信心，

不过，在处理解离的组织或悬浮的细胞时，还是要格外小心。

比如，当细胞静置在管中时，它们开始沉降，因此每次从管

的上部或下部吸取时，有可能吸到不同数量的细胞。正确的

做法是每次移液之前先混合细胞悬液，然后从管的中部吸取。

同时，细胞必须被温柔对待。大家可能不知道，即使用宽口

径的移液吸头，移液混合也会对样本质量产生负面影响。下

图比较了在HEK293T细胞上开展的四种不同的细胞混合实

验对单细胞数据的影响。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导

致细胞过早溶解，释放出RNA，形成背景噪音，最终降低细

胞的reads比例。正确的做法是使用宽口径的吸头来轻柔混

合细胞悬液。洗涤在处理悬浮细胞、解离组织或大量细胞时，

强烈建议彻底洗涤。这可以根据样本类型以及scRNA-seq

方法来调整。建议的洗涤方案是用含有0.04%BSA的PBS

来沉淀和重悬细胞两次，然后用最终体积的PBS和0.04%

BSA来重悬细胞。

过滤大的细胞团块或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风

险。为了避免这种状况，建议在上样之前使用细胞滤网（cell

strainer），孔径大约为30-40μm。不过需要注意的是，