WesternBlotting免疫印迹试剂配制每步操作详解WB常见问题分析分离范围2.docx

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Western（试剂配制和操作步骤）

试剂配制：（一）母液??（二）使用液?

操作步骤：（一）?蛋白样品制备?（二）?蛋白含量的测定?（三）?SDS－PAGE电泳?

（四）转膜?（五）免疫反应?（六）化学发光，显影，定影?（七）?凝胶图象分析

关键词：印迹试剂Western印迹法免疫反应蛋白样品制备SDS－PAGE电泳

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/LTris?HCl

???????????Tris(MW121.14)?????????30.29g

????????????蒸馏水????????????????200ml

??溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

???????????????????PH??????????HCl

???????????????????7.4????????约17ml

???????????????????7.5????????约16m

???????????????????7.6????????约15ml

???????????????????8.0???????约10ml

10％SDS

????????????SDS?????????????????10g

??????????蒸馏水至??????????????100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP）

?????????????????过硫酸胺????????????0.1g

?????????????????超纯水??????????????1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/LTris?HCl（pH8.8）

?????????????????Tris(MW121.14)????????45.43g

??????????????????超纯水????????????????????????200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/LTris?HCl（pH6.8）

???????????????????Tris(MW121.14)????????15.14g

??????????????????超纯水?????????????????????????200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

20％Tween20

Tween20?????????20ml

蒸馏水至????????100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液

（50mmol/LTris?HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100?g/mlPMSF）：

1mol/LTris?HCl（pH8.0）?2.5ml

NaCl??????????????????????????????????????0.438g

TritonX－100?????????????????????0.5ml

蒸馏水至??????????????????????????????50ml?????????????????

混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。

0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）

NaCl????????????????????????????????8.0g

KCl0.2g

Na2HPO4?1.44g(Na2HPO4?.H2O1.56g\Na2HPO4?.12H2O3.58g)

KH2PO40.2g

蒸