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免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验方法

免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗

体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化

学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学

者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织

或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知

的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探

针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看

见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。

一、基本原理：

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗

体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为

探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成

的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，

荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），

可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，

以及利用定量技术测定含量。

二、应用范围：

其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核

酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药

浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内

分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

三、基本实验步骤：

1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预

先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖

玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心

洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制

备细胞涂片。

2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细

胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min.

3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在

加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部

位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-

15min.通透后用PBS洗涤3×5min.

4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次

冲洗5min.

6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育

1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

四、注意事项：

1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出

现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。

2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然

能照出很好的片子。

3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就

是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

4、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍

的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱

落。

5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，

出现假阴性。

6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，

降低和防止非特异性染色。

7、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿

来直接封片,20微升即可，之后片子可保留更长时间。

五、荧光物质：

1、荧光色素

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那

些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧

光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：

(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色

或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量