蛋白质序列分析.docVIP

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肽和蛋白质的直接测序法

目前，肽和蛋白质的测序有三种策略：①根据基因测序的结果，从cDNA演绎肽和蛋白质序列，这种策略简单、快捷，甚至可以得到未分离出的蛋白质或多肽的序列信息。但是，用这一策略得到的一级结构不含蛋白质翻译后修饰及二硫键位置等信息；②直接测序策略；③质谱测序与生物信息学搜索相结合的策略。第①种策略可参考分子生物学的有关专著，第③种策略将在本书蛋白质组与蛋白质组分析一章中介绍，本章介绍直接测序策略。

1953年，FrederickSanger在对牛胰岛素的研究中首先提出氨基酸直接测序的概念，迄今为止，已通过直接测序阐明了几千种蛋白质的氨基酸序列。

在蛋白质序列测定中，因为可以得到的蛋白质样品十分有限，而且蛋白质包含的20种不同的氨基酸表现出不同的化学功能和化学活性，在测序过程中每一次变性或裂解所发生的一系列副反应，将使测定过程变得十分复杂，在蛋白质序列测定中由于没有类似于DNA序列测定中采用的PCR技术可应用，因此，与DNA序列测定相比，蛋白质序列测定在许多方面要复杂得多。其基本的测序过程如下所述。

确定不同的多肽链数目

首先应该确定蛋白质中不同的多肽链数目，根据蛋白质N-端或C-端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定蛋白质分子中的多肽链数目。如果是单体蛋白质，蛋白质分子只含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数应与末端残基的摩尔数相等；如果蛋白质分子是由多条多肽链组成，则末端残基的摩尔数是蛋白质的摩尔数的倍数。

肽链的裂解

当蛋白质分子是由二条或二条以上多肽链构成时，必须裂解这些多肽链。如果多肽链是通过非共价相互作用缔合的寡聚蛋白质，可采用8molL-1尿素，6mo1L-1盐酸胍或高浓度盐等变性剂处理，使寡聚蛋白质中的亚基裂解；如果多肽链之间是通过共价二硫键交联的，可采用氧化剂或还原剂断裂二硫键。然后再根据裂解后的单个多肽链的大小不同或电荷不同进行分离、纯化。

太长的多肽片段不能直接进行序列测定，一般肽片段长度不超过50个左右残基的肽段，当肽段超过这个长度时，由于反应的不完全以及副反应产生的杂质积累将影响测定结果，因此，必须通过特定的反应将它们裂解为更小的肽段。通过两种或几种不同的断裂方法（即断裂点不同）将每条多肽链样品降解成为两套或几套重叠的肽段或肽碎片，每套肽段分别进行分离、纯化，再对纯化后的每一肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。

使肽链中某些特殊位置上的肽键发生断裂，可采用化学反应或酶反应裂解产生若干能够进行测序的小片段。一般将蛋白质样品分为两等份，采用不同的试剂裂解产生两套不同的片段，两套片段在测序完成后，根据他们之间的重叠情况即可重新排序。

1酶解法

蛋白质通过蛋白水解酶的裂解后将产生若干能够代表每个蛋白质特性的肽片段，用于特定的蛋白质裂解的蛋白水解酶包括外肽酶和内肽酶，裂解肽链的N-端或C-端的氨基酸可采用外肽酶，而内肽酶则用于切断肽链中某个特定部位。表10.5为常用的蛋白水解酶。

表10.5用于蛋白质部分裂解的蛋白酶

蛋白酶

酶切位点

内肽酶：

胰蛋白酶

Rn-1=Arg，LysRn≠Pro

胃蛋白酶

Rn=Leu，Phe，Trp，Tyr，ValRn-1≠Pro

糜蛋白酶

Rn-1=Phe，Trp，TryRn≠Pro

内肽酶GluC

Rn-1=Glu

外肽酶：

亮氨酸氨肽酶

R1≠Pro

氨肽酶

所有N-端残基

羧肽酶A

Rn≠Arg，Lys，ProRn-1≠Pro

羧肽酶B

Rn=Arg，LysRn-1≠Pro

羧肽酶C

所有C-端残基

具有高度专一性的胰蛋白酶是最常用的内肽酶，当下一个残基不是Pro时，胰蛋白酶可催化裂解肽链中羧基端（C端）带有正电荷的残基（Arg和Lys），如式(10.15)。将胰蛋白酶消化所获得的特征片段图谱与数据库进行比较，即可进行蛋白质的鉴定，因而被作为一种对已知蛋白质进行鉴定的方法。

(10.15)

在除去裂解位点后，即除去Lys或Arg支链上的正电荷，这个位点上的肽将不再被胰蛋白酶切断。例如，用甲基马来酸酐衍生Lys残基，产生一个不带正电荷的Lys支链，则胰蛋白酶不能将其识别作为一个裂解位点，式(10.16)；而在加上裂解位点后，即在其他氨基酸支链上引入正电荷，会产生一个可被胰蛋白酶识别的新裂解位点。例如，采用如2-溴乙胺使Cys发生氨基烷基化反应，在Cys支链中引入了一个正电荷，则胰蛋白酶能将其识别作为新裂解位点，式(10.17)。通过上述两种方式，就能够更充分地发挥胰蛋白酶对蛋白质的裂解特性。

(10.16)

(10.17)

与胰蛋白酶相比较，内肽酶的专一性略差，所产生的肽片段小，与其它肽