蛋白质的稳定性和稳定化.ppt

添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗PH变化，抗变性剂，抗稀释作用例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，并助于形成“溶剂层”，增加表面张力和溶液黏度，这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用第32页,共60页，星期六，2024年，5月蛋白质非共价相连蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定酶形成的多聚体或聚合体的活力和稳定性也常比其单体高第33页,共60页，星期六，2024年，5月三、化学修饰化学修饰即修饰作用可达到稳定酶的作用，得到可溶性稳定化酶。1.可溶性大分子修饰酶：聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白蛋白，多聚氨基酸2.小分子修饰酶第34页,共60页，星期六，2024年，5月原因：修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象；修饰关键功能基团也会达到稳定化；由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基团有可能形成附加氢键或盐键；用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用；蛋白质表面基团的亲水性；交联酶晶体第35页,共60页，星期六，2024年，5月酶的失活和再活化对于可逆性酶，可以采取相应措施实现其再活化例如：用过量的碘离子使脲酶重新天然化，该酶失活是由于重金属阳离子使巯基中毒引起，再活化的机理是碘离子与结合的金属离子形成碘结合物对于不可逆变性酶，可用下述方法进行再活化：用变性剂使固定化酶伸展成无规则盘绕状态第36页,共60页，星期六，2024年，5月最新进展可将变性的蛋白质分子孤立在反胶束内，蛋白质在反相胶束内可重新折叠成天然状态，而且没有与其他变性分子接触和聚合，此胶束由表面活性剂稳定的水滴构成，并悬浮于异丁烷中。第37页,共60页，星期六，2024年，5月第四节各种酶稳定化方法的比较比较各种不同的酶稳定化方法是困难的，因此制定的了一下一般的标准：①稳定性至少要增加1~3个数量级②应对各种酶失活因素(物理，化学及生物学因素)③稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性④稳定化方法适合各类蛋白质⑤稳定化方法应在体内，体外都适用⑥从经济角度看，方法应具有方法的潜力第38页,共60页，星期六，2024年，5月蛋白质工程定义以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。第五节蛋白质工程第39页,共60页，星期六，2024年，5月蛋白质工程的基本目标：是按预期的结构和功能，通过分子设计和DNA重组技术，对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专一性和稳定性。第40页,共60页，星期六，2024年，5月改变蛋白质稳定性的蛋白质工程方法①DNA改组技术②定点突变技术③组合设计④理性设计第41页,共60页，星期六，2024年，5月DNA改组技术的定义DNA改组(DNAshuffling),也称分子育种(molecularbreeding)或有性PCR(sexualPCR),是以单个基因或多个同源基因(一般为天然存在的基因家族)为模板,将其切割成一系列随机大小的DNA小片段,然后在体外通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)将这些片段随机重组成全长基因,实现同源基因重组,达到分子进化目的的一种技术。第42页,共60页，星期六，2024年，5月随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结构与功能研究的突破，特别是PCR技术的进一步成熟，DNA改组技术(DNAshuffling)更加成熟，使得DNA改组成为蛋白质体外分子进化的主流技术。DNA改组技术具有许多重要优点，例如不需要事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变体的方法。第43页,共60页，星期六，2024年，5月定点突变技术(Sit