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间接ELISA检测抗血清效价

姓名：王贤臣学号：1125400080

（成都医学院医学检验成610500）

【摘要】目的：通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术（ELISA）的原理及

操作过程及间接ELISA检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。方法：

间接ELISA双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。结果：经

过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度，然后在正式实验

确定其浓度，从而再进行研究。讨论：间接ELISA检测抗血清效价的影响因素。

并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比，和分析在实验过程中的注

意事项。

【关键词】抗人白蛋白ABLELISA

前言：1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定用于IgG定量测

定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微

量物质的测定方法。之一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相

载体表面，并保持器免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗

体，这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把

受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载

体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合

物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一

定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标

本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于

酶的催化频率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏

感度。

实验方法：

预实验设计方案：

1、材料与方法

1.1仪器：洗板机（BIO-RADMODEL1575）

SM自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所BIO-RAD

680）

电热恒温箱（上海恒科技仪器有限公司）

移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）

微孔反应板刻度吸管（5ml、1ml）

吸耳球试管架塑料试管封口纸烧杯

1.2试剂：人ALB标准品（SIGMA:A1653SIZE:250MGstorage:2-8℃）

PBS缓冲液：0.1MpH7.4(PBS1L配方pH7.4：磷酸二氢钾

(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯

化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL)

包被液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液

洗涤液：0.05%Tween-PBS(即PBST)(0.05%Tween-PBS1000mlPBS

加500ul吐温）

封闭液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液100mlPBS加1g干酪

素）

显色液（A液、B液Cat:ME002可溶性TMB显色液)

终止液：2MH2SO4

酶标抗体（兔抗羊--HRP，武汉博士德生物工程有限公司）

1.3待测标本：羊抗人ALB（效价1:70批号：201106贮存于4-20℃，有

效期：2年）

1.4方法：

①预实验

包被抗原(100ul/孔)

↓4℃过夜或37℃2h洗涤3次拍干

加封闭液(300ul/孔)

↓4℃过夜或37℃2h洗涤3次拍干