生化分离工程第3讲　细胞的破碎与分离.pptVIP

诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis）5.化学法原理用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法，改变细胞壁或细胞膜的通透性，从而使内含物有选择性的渗透出来．常用化学试剂酸碱，有机溶剂（氯仿，丙酮等），表面活性剂（如十二烷基磺酸钠）作用机理１酸碱改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力减低．２有机溶剂被细胞壁的脂质层吸收后导致细胞壁膨胀破裂．３表面活性剂分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，疏水基团溶解脂蛋白，而亲水基团则向外层，从而使膜通透性改变．某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。5.化学渗透法（Chemicalpermeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。---适用于与膜结合的蛋白溶解其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠（1）表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。（2）EDTA螯合剂能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。（3）有机溶剂（4）变性剂盐酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。不同细胞可采用的化学渗透处理方式细胞类型变性剂清洁剂有机溶剂酶抗生素生物试剂螯合剂革兰氏阴性细菌******革兰氏阳性细菌***酵母菌******植物细胞****巨噬细胞****表适用6.物理法渗透压冲击改变细胞渗透压，细胞快速膨胀而破裂．（菌体总蛋白的４％－７％）冻融法将细胞在低温下冷冻然后在室温下融化，反复多次而使细胞破裂，疏水键破碎而亲水性增强，细胞膨胀破裂．（菌体总蛋白的１０％）干燥法干燥使细胞膜渗透性发生变化而破裂，然后用有机溶剂抽提．将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。7.其他方法1.X-press法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。2.渗透压法（Osmoticpressure）通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。1、使细胞膜的疏水键结构破裂，2、胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。3.反复冻结-融化法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。4.干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥基因工程表达产物后处理基因工程产品优点：既可在原核生物