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流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细

胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门

先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内

进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。

本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行

标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细

胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜

色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁

珠。

1材料与方法

1.1标本收集

收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细

胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，

最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。

2检测方法

2.1采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探

针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜

色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流

式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情

况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携

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带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。

2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR

扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进

行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色

激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件

分析杂交结果得出样本HLA基因型别。

3方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术

上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行

大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个

孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可

靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。

目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方

面（如传染病指标等）的检测和研究。

4讨论

流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分

为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分

析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保

室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。

标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包

括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织

等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则

上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞

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活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情

况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的

标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保

存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对

于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方

式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。

流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定

性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性

等[2]。仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或

同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定

荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞

仪质控中的一种常用的标准品。

精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其

散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说

明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。但细胞周期和倍体

分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小

于2%。灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达

方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数

（MESF）法。该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球

组成（包括未标记荧光的空白微球），表明该微球所标记荧光

物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检

测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪