《生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法》征求意见稿.docx

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T/FDSAXXXX—202X

生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法

1范围

本标准规定了使用核酸荧光底物法测定生物制品中脱氧核糖核酸酶残留量检测的方法。本标准适用于使用核酸荧光底物法测定生物制品中脱氧核糖核酸酶残留量检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成对本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

3术语和定义

3.1

脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease，DNase

水解脱氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。3.2

脱氧核糖核酸酶IdeoxyribonucleaseI，DNaseI

水解单链和双链DNA，产生具有5’-磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸的核酸内切酶。3.3

脱氧核糖核酸酶I活力单位activityunitofdeoxyribonucleaseI

在37℃、pH7.6的溶液中，10分钟内完全降解1μgofpBR322DNA所需的酶量注：一个酶活单位以U表示。

4原理

试样与核酸荧光底物一起孵育，试样中残留的DNase催化核酸荧光底物分解，降解产物在对应波长的激发下会发出荧光，通过荧光检测器检测，外标法定量，测定DNase的含量。

5试剂和材料

5.1水

符合GB/T6882规定的二级水。

5.20.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCl)缓冲液，pH7.6

精密称取12.12gTris-base，缓慢加入HCl调pH至7.6（25℃),混匀后定容至1000mL。

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高温高压灭菌，根据每次测试量分装，于-20℃放置储存。

5.30.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液(Tris-EDTA)缓冲液，pH8.0

精密称取0.61gTris-base，0.19gEDTA-2Na·2H2O，溶于水中，缓慢加入NaOH或HCl调pH至8.0（25℃),混匀后定容至1000mL。高温高压灭菌，根据每次测试量分装，于-20℃放置储存。

5.4核酸荧光底物

人工合成的DNA，带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团的激发和发射波长为Ex/Em=485nm/525nm。干粉形式的核酸荧光底物于-20℃避光储存。

6仪器和设备

实验室常规设备及以下各项：

a)多功能酶标仪或定量PCR仪，配对应波长的荧光检测器；

b)电子天平：精度0.01g或0.0001g；

c)pH计：精度为0.01；

d)恒温水浴锅：精度0.1℃。

7分析步骤

7.1环境要求

所有试验操作均应在洁净的无外源DNase环境中进行。所有试验操作均应使用洁净的无外源DNase耗材。

7.2试验溶液的制备

7.2.1核酸荧光底物溶液

将干粉状核酸荧光底物用Tris-EDTA缓冲液溶解，并稀释至100μmol/L高浓度底物溶液，根据每次测试量分装，于-20℃避光储存。测试前取出100μmol/L高浓度溶液恢复至室温，并用Tris-EDTA缓冲液稀释至2μmol/L低浓度底物溶液，稀释后的低浓度底物溶液现配现用。

7.2.2样本稀释溶液

将0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl）缓冲液，pH7.6用水稀释10倍。稀释后的样本稀释溶液现配现用。

7.2.3固体样品待测液制备

根据标称，称取固体待测样品适量，溶于样本稀释溶液中，调节溶液DNase活力在10-6~10-5U/μL，调整后的待测液需当天及时检测，且避免冻融。

7.2.4液体样品待测液制备

根据标称，用样本稀释溶液调节待测液体样品的DNase活力在10-6~10-5U/μL，调整后的待测液需当天及时检测，且避免冻融。

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7.2.5标准品溶液制备

以DNaseI（2U/μL），为标准品，用样本稀释溶液稀释至1×10-5U/μL、5×10-6U/μL、2.5×10-6U/μL、1.25×10-6U/μL。稀释后的标准品溶液需当天及时检测，且避免冻融。

7.3酶促反应（37℃)

按表1加入酶促反应液至96孔板中，每个供试品、标准品和对照品平行两孔，振荡混匀后，立即置于酶标仪