植物转基因技术.pptVIP

IntegrationofT-DNAintothechromosomeofhostplant

T-DNA整合到植物染色体上首先在植物靶DNA上出现一个缺刻(nick)随着DNA解链，宿主细胞的5’—3’外切酶活性使缺刻扩大成裂口(gap)T-DNA侵入裂口，末端与靶DNA单链上的少数核苷酸配对形成异源二倍体；T-DNA悬挂在外侧的末端被切割除去，T-DNA与靶DNA末端相连；靶DNA上链出现缺刻，以整合后的T-DNA下链为模板合成T-DNA的第二条链，完成整合过程。Ti质粒的改造当人们试图利用天然Ti质粒进行基因工程操作时，发现它有许多缺陷。首先，由于T-DNA区存在生长素和细胞分裂素基因，它们在植物细胞中的过量表达诱导肿瘤，使植物细胞不能再生植株，因此不可能获得转基因植株。其次Ti质粒分子量较大，其限制性内切酶图谱很复杂，用一种限制性内切酶进行酶切时往往有几十个切点，这样一来不仅在酶切后外源基因插入的位点不能确定，而且酶切的片段也很难按原来的顺序回接。第三，插入外源DNA的Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，也很难再转化农杆菌。这一切都限制了Ti质粒在植物基因工程中的应用，因此必须对其进行改造和重新构建。对野生型Ti质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tar和tmt基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆