新疆油鸡禽流感病毒Xj14分离株PA基因的克隆与序列分析.docx

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新疆油鸡禽流感病毒Xj14分离株PA基因的克隆与序列分析

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武军元++黄忠武++康强++姚礼文

摘要：为了从分子水平上掌握新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PA基因的遗传进化情况，采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株Xj14的PA基因进行克隆、测序及分子进化分析，将PA基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与GenBank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明，新疆油鸡分离株的PA基因由2151个碱基组成，编码716个氨基酸，与AIVA/Duck/HongKong/Y439/97的PA基因处于同一分支，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为899%和96.9%，在系统进化上属于欧亚分支中的Y439谱系。

关键词：禽流感病毒；油鸡；PA基因；克隆；序列分析

：S852.65+7文献标志码：A：1002-1302（2017）08-0020-03

禽流感（avianinfluenza，AI）是由A型流感病毒（avianinfluenzavirus，AIV）引起的病毒性传染病。自Homme等1966年从威斯康辛州患有温和呼吸道疾病的火鸡中分离到第1株H9N2亚型禽流感病毒之后，该亚型病毒在世界范围内呈广泛流行的趋势[1-4]。我国1994年首次从广东省的发病鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒[5-6]，1998年首先报道H9N2亚型AIV可以感染人[7]，1999年我国香港地区发生了人感染H9N2的病例[8]。进一步的研究结果表明，1997年我国香港地区感染人的H5N1病毒的内部蛋白基因片段来源于H9N2亚型AIV[9]；2013年发生于我国上海等地的重配病毒H7N9中6个内部基因均来自H9N2亚型AIV[10]；刘金华等近期发表在PNAS上的研究结果揭示，单一基因型H9N2流感病毒在我国鸡群中的优势流行为H7N9流感病毒的重排提供了充分条件[11]。A型流感病毒基因组由8个单股负链RNA片段组成，它们编码11个已知的病毒蛋白质，RNA聚合酶是由流感病毒基因组3个最大的片段PB1、PB2和PA编码的异源三聚体复合物。其中，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制以及转录、PB2以一种称为“Snatch”的方式参与宿主mRNA帽状结构的切割而完成病毒mRNA的转录[12]。近年来的研究结果表明，PA亚基不但参与病毒复制过程，而且参与病毒RNA轉录、决定内切核酸酶和蛋白酶的活性，以及参与病毒粒子组装等多种生命活动过程，基于筛选慢性肝炎和艾滋病药物的启示[13]，PA蛋白因可以抑制病毒的复制转录、有效发挥抗病毒作用而成为新型抗流感药物研发的潜在靶点。

由此可见，加强对不同物种H9N2亚型AIV的检测，密切关注其重配情况，进一步对其生物学特性以及分子流行病学进行研究，对于预测和防控流感大流行的发生具有不可忽视的作用。本研究对从新疆油鸡当中分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒进行PA基因克隆测序，并进行分子进化分析，以了解新疆油鸡H9N2亚型AIVPA基因遗传进化的情况。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒H9N2亚型禽流感病毒新疆油鸡分离株A/Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014（H9N2）（简称Xj14）于新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室分离保存。

1.1.2主要试剂及仪器设备HighPureViralRNAKit（Cat.No.11858882001）购自Roche公司；PrimeScriptTMⅡFirst-strandcDNASynthesisKit（Cat.No.6210A）购自宝生物工程（大连）有限公司；HiPureGelPureDNAKits购自Magen公司；pGEM-TEasyVector购自Promega公司；Trans2KDNAMarkers、TransTaq-TDNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司；TIANprepMiniPlasmidKit购自天根生化科技有限公司。梯度PCR仪、全自动凝胶成像分析系统、高速离心机为德国Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1引物设计参照已知的AIV序列设计了1条反转录通用引物Uni12，用于AIV各片段的反转录扩增，序列为Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。

参考NCBI公布的H9N2亚型AIV的PA基因序列，利用Primerpremier5.0软件设计一对基因特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列为Bm-PA-1：5′-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC-3′；Bm-PA-2：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT