【精品】核酸分子杂交-2010-12-27.docx

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核酸分子杂交

NucleicAcidHybridization

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主要内容

1核酸分子杂交的基本原理

2核酸分子杂交的基本方法

3生物芯片技术

4核酸探针的制备及标记

5影响核酸分子杂交的基本因素

核酸分子杂交技术的发展史

Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。

Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。

60年代末，Britten等研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，用UV260nm的吸光度来监测互补链的复性程度。

60年代中期Nygaard等将DNA或RNA探针固定在硝酸纤维素(NC)膜上。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。是现代膜杂交实验的基础。

70年代末期到80年代早期，分子克隆成为可能。可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，制备大量的探针DNA

1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了Southern印记杂交技术，用于转化子的分析。

固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生。3

4

PhillipA.Sharp(1944-)

PhillipA.Sharp

(1944-)

(1943-)

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993.

fortheirdiscoveriesofsplitgenes

2006年上海交通大学微生物研究所

法国科学家Chambon的遗憾

鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图5

鸡卵清蛋白基因及其转录转录后修饰

鸡卵清蛋白基因及其转录转录后修饰

鸡卵清蛋白基因

hnRNA

首、尾修饰3GppG+

hnRNA剪接4

成熟的mRNA5

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第一节

核酸分子杂交的基本原理

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变性

复性

核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理

核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理的基础上产生和发展起来的。

一、DNA变性与复性

DNA

DNA变性是指在物理或化学因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双链DNA分子变成两条单链DNA的过程。

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引起核酸变性的因素

酸碱热变性剂

酸碱热

有机溶剂(乙醇

丙酮)

变性后DNA

其它理化性质变化

增色效应粘度下降

酸碱滴定曲线改变生物活性丧失

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(A值)

0.6

0.6

82℃

0.4

0.2

天然(25℃)

0

180240260280300

波长(nm)

相对吸收光值

相对吸收光值

OD260(A260)

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增色效应：DNA变性时，其溶液OD?60增高。

Tm:双链DNA变性一半所需要的温度称为解链温度或融解温度(meltingtemperature,Tm)。

不同的DNA具有不同的Tm值，一般为70~85℃,其大小与

G+C含量成正比。14

1.48

1.44

PneumocoCcus

1.40

相对吸收(260nm

相对吸收(260nm)

1.36

1.32

1.281.24

1.20

1.16Serratia

1.12

1.08

1.04

1.00

74767880828486889092949698100

不同DNA的Tm比较

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DNA

DNA的复性(renaturation)

定义：

变性DNA在适当条件下，两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

减色效应：

DNA复性时，其溶液OD?60降低。

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复性过程中的碱基配对

非配对相瓦作用

非配对相瓦作用

配对相互作用

配对相互作用

A

丁

CrC核酸螺旋化

DD

1

门式0

门式

E

4

快速配对

。

。

D

■

B

C

门D

门

B

(

D

i

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影响复性速度的因素：

DNA浓度

DNA片段的大小DNA片段复杂性

合适的复性温度适当的离子强度

DNA-RNA

杂交双链分子

复性DNA