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慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤--第1页

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一、包装细胞293T细胞的培养

一、293T细胞的冻存

1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞

购进时就进行冻存。

2.在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3.倒去细胞上清液，加入D-Hanks液洗去残留的培养基。

4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5.镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6.细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细

胞，密度为3×10个/ml。

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10.第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代

1.当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维

持细胞良好的生长状态。

2.消化细胞，方法同上。

3.细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏

1.当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要

丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2.打开水浴锅，设置温度为40℃。

3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），

迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。

4.将1ml细胞溶液加入9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5.放回37℃、3%CO和95%相对湿度的培养箱中培养。

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6.第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下

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慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤--第2页

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5-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3(forwardprimer),

5-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3(reverseprimer)and

5-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3(probe)

2.TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems，cat.no.

4304437)

3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems，cat.no.

401970)

4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems，cat.no.4316844)

用于包装的293T细胞的培养

用于包装的293T细胞(ATCCNo.C