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细菌的生理生化鉴定方法--第1页

方法

2.3.5细菌的生理生化鉴定

１、形态学观察

采用插片法、埋片法,对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏

染色进行油镜观察。

①革兰氏染色

溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番

红复染液等。

试验步骤：(1)涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干

燥和固定。

(2)初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出

水无色。

(3)媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，

水洗至流出水无色。

(4)脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出

液无色时立即用水洗去乙醇。

(5)复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，

用吸水纸吸去残水晾干。

(6)镜检：用油镜观察。

②芽孢染色

(1)制片：按常规方法涂片、干燥及固定。

(2)加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹

住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切

勿让涂片干涸。

脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。

(3)复染：用0.5%番红水溶液复染2min。

(4)水洗：用缓流自来水冲洗至无色。

(5)镜检：晾干载玻片后油镜镜检。

③鞭毛染色（硝酸银染色法）

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(1)载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后

用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可

能残留的油迹。

(2)菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌

悬液，不能剧烈震荡。

(3)制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，

用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。

(4)染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴

加B液染色约1min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水

冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。

(5)镜检：用油镜镜检观察。

A、B液需现用现配（4h果最佳，1d内可用）：

A：单宁酸5ｇ，三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15%

甲醛2mL。

B：硝酸银粉末2ｇ，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL

溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴

至出现薄雾。

２、糖类分解试验

配方：蛋白胨1.0ｇ；NaCl0.5ｇ；0.2%溴百里香酚兰1.2mL；葡萄糖1.0

ｇ；蒸馏水100mL。

基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利

用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二

氧化碳等）。当发酵产酸是，指示剂可有紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气

体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。

试验步骤：用记号笔在