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实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定

一、实验目的

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜

温，极易分离与培养。由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并

且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治

且备受关注。本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生

理生化特征进行纯化和鉴定及16SrDNA基因序列进行分析。

二、实验原理

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无

荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，

位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在

液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形

成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清

楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

枯草芽孢杆菌的分离方法：

（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐

挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌

的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步

的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、

磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过

试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖

3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度

(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。可利用此方法在培养16小时后分离枯草芽孢杆

菌。

枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定试验主要进行接触酶，V-P反应，糖发酵产酸，水解淀粉，

柠檬酸盐利用，硝酸盐还原，厌氧生长。

三、实验材料和设备

1、培养基

（1）选择性培养基

酵母膏0.5克

蛋白胨0.83克

磷酸二氢钾0.35克

琼脂15克

蒸馏水1000毫升

无水葡萄糖3.5克

PH7.0-7.2

121℃灭菌20min后倒平板

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