TCAAA 113-2023 梅花鹿体细胞冷冻技术规范.docx

ICS65.020.30

CCSB44

团体标准

T/CAAA113—2023

梅花鹿体细胞冷冻技术规范

Specificationofsomaticcellfreezingforsikadeer

2023-10-10发布2023-11-30实施

中国畜牧业协会发布

T/CAAA113—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国畜牧业协会提出并归口。

本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学、哈尔滨工业大学、哈尔滨博蒙生物科技有限公司、黑龙江普惠特产有限公司、黑龙江省农垦科学院、黑龙江省农业科学院。

—本文件主要起草人：韩欢胜、王雪、郭喜明、郑家三、许艳丽、张爱忠、赵树臣、徐馨、赵晓静、王伟、梁宇祥、柴孟龙、道楞、赵育国、孙义乐、王敏、史文清、韦春波、张莹、李美鑫、贾志英、王峥、宋军、杜佩泽、尚念鹏、张馨元、张岩、彭新宇、王纪元。

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T/CAAA113—2023

梅花鹿体细胞冷冻技术规范

1范围

本文件规定了梅花鹿体细胞冷冻的基本要求、组织采集前准备、组织采集、组织运送、细胞培养、细胞冷冻保存、细胞复苏、细胞质量检测、细胞贮存与档案管理。

本文件适用于梅花鹿体细胞遗传资源的冷冻保存。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

细胞原代培养primarycellculture

直接从机体取出的细胞、组织和器官分散成细胞后进行的首次培养。

3.2

细胞传代培养cellsubcultureculture

将培养的细胞分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再继续培养的过程。

3.3

细胞系cellline

原代细胞培养物经首次传代成功后所增殖的细胞群体，可泛指一般可能连续传代的细胞。

3.4

细胞冻存cellcryopreservation

将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，使其于液氮中长期保存的过程。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

FBS:胎牛血清(fetalbovine

serum)

PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate

buffered

saline)

5基本要求

5.1实验室应干净、清洁、无菌，满足细胞培养条件。

5.2细胞样品处理、培养和冻存操作应在生物安全柜中进行。

5.3用于体细胞冻存的鹿应临床健康，经检疫无法定动物疫病。

5.4操作人员应严格消毒，做好防护，戴手套、口罩，穿工作服。

6组织采集前准备

应调试设备，准备消毒器械，配制试剂，具体参见附录A。

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7组织采集

7.1采集鹿耳缘(尖)组织。

7.2采样前应对鹿进行机械保定或麻醉保定。

7.3鹿保定好后按实际采样组织面积的1.2倍用剃毛工具除净采样部位耳毛。

7.4按75%酒精→5%碘酒→75%酒精→生理盐水的先后顺序，对剃毛后的采样部位进行消毒脱碘清洗。

7.5用采样钳快速剪取耳缘(尖)组织样。

7.6将组织样本用75%酒精喷雾消毒，并快速放入含有2%双抗的PBS中涮洗3遍。

7.7将涮洗后的组织样快速的放入含有2%双抗的PBS的15mL的离心管中，用封口膜封口。

7.8记录样本名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号及采样时间等信息，具体参见附录C。

8组织运送

将封存好的组织样放入保温箱冷藏条件下4h内运回实验室，尽快进行原代培养。

9细胞培养

9.1原代培养

9.1.1将组织样放入培养皿再次消毒，用含有2%双抗的PBS中洗涤3次。

9.1.2在皿中用镊子进一步去掉组织块表皮上的耳毛。

9.1.3用PBS清洗后将组织块转移到新皿中，剪成1mm3左右的碎块。

9.1.4用1.6mg/mL的胶原酶IV在37℃的恒温水浴摇床上消化30min后取出，间隔5m