第十章-园艺植物遗传转化.ppt

章园艺植物遗传转化

;;第一节园艺植物遗传转化受体系统

第二节园艺植物遗传转化方法

第三节园艺植物转化植株的鉴定

第四节提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略

第五节基因沉默技术与基因剔除技术

第六节外源基因在园艺植物中的遗传;植物遗传转化(plantgenetictransformation);第一节园艺植物遗传转化受体系统;一、遗传转化对园艺植物受体系统的要求

高效稳定的再生能力

(2)较高的遗传稳定性

(3)稳定的外植体来源

;;(5)对农杆菌侵染的敏感性

在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作为受体系统

农杆菌敏感性试验的原理是利用野生型农杆菌能在外植体组织中形成肿瘤或发根，根据肿瘤的诱导率、发生时间及生长状态判断其敏感程度。其操作程序是把常用的菌株接种在固体琼脂平板或液体培养基中，用牙签挑取菌体，穿刺受体植物组织。可在同一植株的不同部位——叶片及其中脉、花、茎和幼茎的节间多次接种，比较其敏感性。然后将植株在光照几周后观察肿瘤或发根的诱发情况，能形成肿瘤或发根，则说明该植物材料可作为农杆菌的一个宿主，可用农杆菌介导转化。

;二、常用的园艺植物受体系统

1、组织受体系统

2、原生质体受体系统

3、生殖细胞受体系统;（1）组织受体系统

定义：利用园艺植物的叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体培养获得再生植株的受体系统为组织受体系统。

;2023/5/24;优点：转化率高、外植体来源容易、转化植株易扩繁、适用广泛等；

缺点：外源基因遗传稳定性差、嵌合体多

;b）直接分化再生系统：不经过愈伤组织阶段，直接分化出不定芽获得再生植株

优点：操作简单、体细胞无性系变异小等

缺点：转化率低、嵌合体多;（2）原生质体受体系统

;（3）生殖细胞受体系统

定义：利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统，也称为种质系统。

;;2023/5/24;利用生殖细胞进行遗传转化，主要有两种途径：

2）直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。;2023/5/24;与其他受体系统相比生殖受体系统具有以下优点：

1）以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能

2）受体细胞是单倍体细胞，转化的细胞无显隐性的影响，能是基因充分表达，有利于性状的选育。单倍体植株通过加倍后即可成为纯和的二倍体纯系，大大缩短了复杂的选育纯化的过程

3）利用植物自身的授粉过程进行遗传转化，操作方便、简单。

局限性：生殖受体系统受季节限制，只能在短暂的开花期进行。;第二节园艺植物遗传转化方法;一、外源裸露DNA的转化

（一）化学诱导转化法

化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。

目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。

;1、转化原理

转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性，诱导原生质体摄取外源基因DNA。;;2、转化的基本步骤及其应用

PEG介导的遗传转化一般包含以下步骤：

a）外源目的基因的制备

b）原生质体制备

c）目的基因和原生质体的转化培养

d）转化体的鉴定和再生植物的培养

目前PEG介导的遗传转化法在花椰菜、胡萝卜、向日葵、卡特兰、柑橘等园艺植物上均有成功的报道。;3、优缺点

1）优点：

a）操纵简单、成本低，无需昂贵的仪器设备；

b）可同时操作多个样品，获得高存活率和分化率的转化细胞；

c）DNA直接导入可用于对基因的瞬时表达进行快速分析；克服了农杆菌介导转化对受体植物范围的限制；

d）建立了原生质体再生体系的植物和组织都可适用，其结果比较稳定，重复性好。

;2）缺点：

转化率低，一般为10-5~10-3。;（二）电穿孔转化法

电穿孔转化法，又称电击法或“电注射法”。Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat基因导入玉米原生质体。

;1、转化原理

1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4nm左右，每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入；

2）电穿孔法分为两类：

高压短时程法可以得到较高的DNA整合率

低压长时程法可以使其达到较快的修复，从而得到较多的瞬时表达产物;;;2、操作程序及其应用

电穿孔法一