真核基因在大肠杆菌中的表达形式.pdfVIP

真核基因在大肠杆菌中的表达形式--第1页

真核基因在大肠杆菌中的表达形式

大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定

位于这3个腔内。真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可

分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。胞内表达是最主要的表达形式，表达产

物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。而根据表

达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。

一、胞内表达

1、非融合表达

非融合表达即直接表达天然蛋白，所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含

有任何原核肽段。真核基因通常缺乏能被原核生物的转录和翻译系统识别的序

列，包括启动子、有效地核糖体结合位点，有时还缺乏ATG起始密码子和转录

终止子，因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。

有时，非融合表达不能产生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫

氨酸时。由于甲硫氨酸是由ATG编码的，在大肠杆菌中，氨基端的甲硫氨酸会

被不同程度地去除。此外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏，产生无活性的蛋

-

白，这是影响表达效率的重要因素。克服的方法有：①采用Ion营养缺陷型宿

-

主。大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷（Ion），用Ion宿主，使蛋

白酶不能合成，从而保护真核蛋白；②克隆Pin基因。T4噬菌体Pin基因产

物为细菌蛋白酶抑制剂，将Pin基因克隆到质粒上，并转化大肠杆菌，可保护

真核蛋白。

2、融合表达

融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段，融合表达的方法是

1/7下载文档可编辑

真核基因在大肠杆菌中的表达形式--第1页

真核基因在大肠杆菌中的表达形式--第2页

将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游，以产生融

合蛋白的方式表达目的基因。由于融合基因5端为表达载体中的原核基因序

列，已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰，因此，融合表

达的效率高。需要注意的是，插入基因的转录方向和阅读框架必须与原核片段

的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则不能表达。

融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白，常用的后处理方法有溴化氰和

蛋白酶裂解，这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰

和蛋白酶裂解的序列，而且目的蛋白内部不能含有溴化氰和蛋白酶切割位点。

溴化氰能切割蛋氨酸残基后的肽键；牛凝血因子X用Russel蝰蛇毒液活化成

因子X后，能在四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg中的精氨酸（Arg）后特异地切割

a

肽链；凝血酶（thrombin）也能识别和切割特定的肽序列，这些识别序列通常

都已构建于融合表达载体中。

融合表达有以下几个优点：

①由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控，因此融合蛋白通常

得到高效表达；

②真核基因与大肠杆菌基因的融合产物比天然真核蛋白更稳定；

③表达蛋白的纯化较为困难，但与特定的原核蛋白融合后，可以利用识别

原核肽段的配体进行亲和层析纯化。将真核基因与谷胱甘肽硫转移酶

（glutathione-S-transferase,GST）基因融合，表达的融合蛋白可用

谷胱甘肽亲和柱纯化。蛋白A（proteinA）是金黄色葡萄球菌细胞壁

上的一种蛋白成分，能与免疫球蛋白IgG结合，将目的基因与蛋白A

基因融合，产生的融合蛋白可以用偶联有IgG