玉米粉建模豚鼠阿尔茨海默氏病淀粉样变性脑血管病的病理学变化研究.docxVIP

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玉米粉建模豚鼠阿尔茨海默氏病淀粉样变性脑血管病的病理学变化研究

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基金项目：湖南省教育厅一般项目，湘财教指（2013）96号编号：13C1116

摘要：目的在建立实验性豚鼠阿尔茨海默氏病动物模型基础上探讨淀粉样变性脑血管病变的脑组织病理变化特点。方法采用豚鼠颈总动脉内注射玉米粉，通过脑血管沉积淀粉蛋白,建立阿尔茨海默氏病动物模型,应用水迷宫试验评价豚鼠高级认知功能情况,应用HE染色、刚果红染色以及a-actin、Ap双重标记免疫荧光染色观察淀粉样蛋白在豚鼠脑内沉积与淀粉样变性脑血管病变的动态变化情况。结果实验组与对照组相比逃避潜伏期时间和平台探索次数均有显著性差异。HE染色可见实验组豚鼠海马区颗粒细胞减少,细胞变性,胶质细胞增生,海马内小血管壁变性。刚果红染色可见玉米粉逐渐沉积在小血管壁,管壁增厚,小血管狭窄或闭塞，免疫荧光染色可见实验组脑组织内Ap纤维逐渐向小动脉迁移。结论使用玉米粉可以实验性导致微血管栓塞,微血管渗漏及早期神经轴突病变或淀粉蛋白沉着存在正相关能淀粉样变性脑血管病变是阿尔茨海默氏病的主要病理变化。

关键词:玉米粉；脑血管病阿尔茨海默氏病；淀粉样蛋白；豚鼠

阿尔茨海默氏病Alzheimersdisease,AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,主要病理特征是在大脑皮层和海马出现淀粉样蛋白（Ap）聚集形成的老年斑(SP)[1]。近年来发现,淀粉样变性脑血管病变CAA也是AD的主要病理学特征,甚至在AD的发病过程中扮演着主要角色,但其发生机制仍不明确，制约了AD的临床诊断和治疗。探明CAA的病理机制具有重要意义,有助于疾病的早期诊断和找到新的治疗靶点[2]。本课题组采用颈总动脉内注射玉米粉导致微血管栓塞,微血管渗漏及早期神经轴突病变或淀粉蛋白沉着制备AD动物模型,探讨淀粉样蛋白在脑组织内沉积的规律,并观察CAA的动态变化特点。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物及分组清洁级健康雄性SD豚鼠40只,体质量200?250g,由长沙医学院基础医学院实验动物中心提供。豚鼠随机分为实验组和对照组,每组分为4个亚组：1、2、4、12周,每个亚组各5只。。

1.1.2主要仪器10Ml微量注射器（Hamilton),冰冻切片机LEICACM1850),各种规格可调加样器(Eppendorf,小动物行为记录分析系统TSEsystems),荧光显微镜(OlympusDP71),图像分析软件OlympusDPManaged,-80X低温冰箱(ThermoScientific)

1.1.3主要试剂玉米粉(上海星城生物有限公司),多聚甲醒(广州化学试剂厂），刚果红（上海试剂三厂），AntiAmyloidbetaA4protein(Milliporo),anti-a-actin（Miliiporo),GoatAntichicken(JacksonImmunoResearch),GoatAntiRabbit、GoatAntiMouse（nvitroger),山羊血清工作液（上海金桥），抗荧光衰减封片剂(北京普利莱基因)。

1.2方法

1.2.1玉米粉的制备将玉米粉末溶于灭菌PBS溶液中,配制成浓度为5%的悬液,将配好的玉米粉置于37℃恒温水浴摇床中,振荡水浴7d备用。

1.2.2动物模型的制作40只豚鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg）麻醉动物后，颈部皮肤消毒，旁正中切口暴露颈总动脉。用22号头皮针（带蝶翼，尾部连接铁弗龙taflon导管）从尾侧向头侧方插入颈总动脉，用缝线将针管部分固定于周围组织，铁弗龙导管的另一端连3ml的注射针筒。针筒安装入定速微量灌流仪。针筒内盛装新鲜配制的5%玉米粉生理盐水稀释液，按具体实验预设定的速度灌流，玉米粉稀释或生理盐水（对照组）。颈总动脉灌流完成后，动物或存活至预设定的存活点。Morris水迷宫试验各组豚鼠的4周和12周亚组在造模前和造模4周后进行水迷宫试验,1周和2周组造模时间过短不进行水迷宫试验。按参考参文献方法：学习训练海只豚鼠依次从4个象限投入水中,记录动物找到水下平台的时间。每次训练4个象限,每只动物每天训练4次,连续训练5d；定位航行试验在学习训练结束后第5天进行,将豚鼠从某一固定象限投入水池中,记录找到平台的时间,为逃避潜伏时间”，120s内找不到平台者记为120s,连续测试4d；空间探索试验在定位航行试验后进行,撤走安全平台,将豚鼠从某一固定象限投入水中,记录豚鼠120s内平台探索次数。

1.2.4脑组织取材各组豚鼠分别于术后1、2、4、12周用冰冻生理盐水及4%冰冻多聚甲醛溶液经心脏灌