单克隆抗体制备流程.ppt

****单克隆抗体制备流程

Preparationofmonoclonalantibodies单克隆抗体简介单克隆抗体的生产单克隆抗体的应用01020304制备流程目录01单克隆抗体简介1.1抗原（antigen）定义：能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与抗体和致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。类型（来源）：异种抗原：病原微生物、类毒素等不同种族之间的抗原；同种异型抗原：存在于同一种族不同个体之间的抗原，如ABO血型抗原、Rh抗原,、MHC等；自身抗原：自身成分，分为隐蔽的自身抗原、改变的自身抗原等，如眼晶状体蛋白等；异嗜性抗原：又称Forssman抗原，存在于不同物种间表面无种属特异性的共同抗原，可存在于动物、植物、微生物及人类中，如溶血性链球菌于人心内膜或肾小球基底膜所具有的共同抗原就是异嗜性抗原。在单克隆抗体制备中：通常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。1.2抗体（antibody）定义：由效应B细胞分泌，用来鉴别与中和抗原的大型Y形蛋白质，仅在脊椎动物的血液等体液中及其B细胞的细胞膜表面发现。类型（按理化性质和生物学功能）：IgM：免疫应答中首先分泌的抗体。与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬；IgG：激活补体（辅助和补充特异性抗体），中和多种毒素。IgG持续的时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。他们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿得到保护；IgA：进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一类抗体；IgE：抗体的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。这也是引发速发型过敏反应的抗体；IgD：作用还不清楚。主要出现在成熟的B淋巴细胞表面上，可能与B细胞的分化有关。在单克隆抗体制备中：通常是产生IgG型抗体1.3特异性免疫-体液免疫1.4单克隆抗体定义：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。类型（来源）：鼠源性单克隆抗体：将免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的杂交瘤细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。嵌合性单克隆抗体：用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。可大幅降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。人源化单克隆抗体：利用现有的已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。全人源单克隆抗体：抗体可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术（phagedisplay）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenicmouse）和单个B细胞抗体制备技术等。1.5杂交瘤技术杂交瘤(hybridoma)抗体技术：在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。02制备流程实验原理2.1抗原准备2.1.1分子克隆与蛋白纯化提取目的基因：在数据库中查找目的基因序列，设计引物，PCR扩增目的基因构建载体：将扩增的目的基因构建到质粒上，转入宿主中诱导表达：通过化学试剂诱导宿主大量表达蛋白蛋白纯化：用特定的方式将目的蛋白提取出来并纯化2.2动物免疫2.2.1动物免疫与效价测定抗原乳化：将抗原与佐剂混合，在乳化器上进行乳化腹腔注射：将乳化好的抗原通过腹腔注射进入小鼠体内，两周后再注射一次测定效价：尾部取血后分离血清，通过ELISA法测定小鼠血清效价加强免疫：融合前三天进行加强免疫，不加佐剂，只注射抗原2.3细胞融合2.3.1细胞融合与培养骨髓瘤细胞培养：提前复苏并扩大培养SP2/0细胞取脾脏：处死小鼠，取其脾脏并研磨制成细胞悬液细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合后，加入PEG促进