原创力文档- 1、本文档共5页，可阅读全部内容。
- 2、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 6、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项--第1页
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧
光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescence
labelingmethod)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如
抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的
荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可
对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵
育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别
标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显
微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位
和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，
且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不
同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据
抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项--第1页
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项--第2页
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS(1：
1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过
长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
(1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物;
(2)阴性对照：阴性血清+荧光标记物;
(3)荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家
兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey
anti-rabbit-FITC(绿)和donkeyanti-rat-Tex-Red(红)。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体
浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比
较清晰。
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项--第2页
免疫荧光双标实验操作方法与注意事项--第3页
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔
和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常
donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫组化双重染色方法和步骤
在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否
在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双
重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶
文档评论（0）