酶的提取与分离纯化课件课件.ppt

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*2.操作:(SDS及PAGE,即变性及非变性)1)制胶:(变性:buffer中加0.4%SDS)a.分离胶:根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶(查表),配制分离胶溶液:Acr:Bis=29:1,分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶,加水使液面平坦,室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶:用浓缩胶buffer。插上梳子。第224页,共262页,星期六,2024年,5月*2)样品制备:a.PAGE:样品+样品缓冲液(蔗糖或甘油+指示剂溴酚蓝)b.SDS:样品+样品缓冲液(SDS,甘油,巯基乙醇,溴酚蓝),煮沸2~5min,以除去亚稳态聚合。3)加样及电泳:SDS:电极buffer中加0.1%SDS,溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。第225页,共262页,星期六,2024年,5月*4)固定及染色a.固定:将凝胶浸于7%乙酸或12.5%三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色:考马斯亮蓝染色法银染法(灵敏度比前者高100倍)其它的染色方法:氨基黑、阿尔辛蓝,过碘酸-Schiff试剂(糖蛋白)。第226页,共262页,星期六,2024年,5月*电泳胶实例第227页,共262页,星期六,2024年,5月*四、等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性,以聚丙烯酰胺为电泳支持物,在其中加入载体两性电解质(商品名:Ampholine,一种含有各种连续pI的小分子混合物)的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IEF)。第228页,共262页,星期六,2024年,5月*1.原理两性电解质载体在电场作用下,按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动,当迁移至pH值等于pI处时不再泳动,被浓缩成狭窄的区带。第229页,共262页,星期六,2024年,5月*两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水,有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。第230页,共262页,星期六,2024年,5月*等电聚焦电泳第231页,共262页,星期六,2024年,5月*2.操作:1)凝胶配制:凝胶浓度T为5%~7.5%(C=3%左右)2)加样:任意位置第232页,共262页,星期六,2024年,5月*3)电泳:阳极:磷酸溶液电极溶液阴极:NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压(600V)时,才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。4)固定及染色:TCA固定,考马斯亮蓝染色。第233页,共262页,星期六,2024年,5月*5)等电点测定:Marker与未知样品同时电泳染色后,以pH值为纵轴,距阴极距离为横轴,做pH梯度标准曲线,据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI第234页,共262页,星期六,2024年,5月*第四节酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶第235页,共262页,星期六,2024年,5月*(二)超滤浓缩超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力,将待浓缩溶液通过超滤膜,酶分子较大被滞留,水分子和小分子选择性透过,达到浓缩目的。图4-61酶的超滤浓缩第236页,共262页,星期六,2024年,5月*6.应用1)纯化带“标签(tag)”蛋白如:带有His-tag,GST-tag蛋白纯化2)抗体及Fc融合蛋白纯化ProteinA第192页,共262页,星期六,2024年,5月*(六)反相层析——高效(压)液相层析(HPLC常用于分析)反相层析原理:同疏水层析,常用于高效液相层析特点:①使用的固相支持剂颗粒很细(5um),表面积很大,因而分辨率很高。②溶剂系统采用高压,因此洗脱速度增大。固定相(柱填料):常用

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