酶的提取与分离纯化课件课件.ppt

*2.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。第224页,共262页，星期六，2024年，5月*2）样品制备：a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。第225页,共262页，星期六，2024年，5月*4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：考马斯亮蓝染色法银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。第226页,共262页，星期六，2024年，5月*电泳胶实例第227页,共262页，星期六，2024年，5月*四、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。第228页,共262页，星期六，2024年，5月*1.原理两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。第229页,共262页，星期六，2024年，5月*两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。第230页,共262页，星期六，2024年，5月*等电聚焦电泳第231页,共262页，星期六，2024年，5月*2.操作：1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%左右）2）加样：任意位置第232页,共262页，星期六，2024年，5月*3）电泳：阳极：磷酸溶液电极溶液阴极：NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。第233页,共262页，星期六，2024年，5月*5）等电点测定：Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI第234页,共262页，星期六，2024年，5月*第四节酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶第235页,共262页，星期六，2024年，5月*（二）超滤浓缩超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61酶的超滤浓缩第236页,共262页，星期六，2024年，5月*6.应用1）纯化带“标签（tag）”蛋白如：带有His-tag，GST-tag蛋白纯化2)抗体及Fc融合蛋白纯化ProteinA第192页,共262页，星期六，2024年，5月*(六)反相层析——高效（压）液相层析（HPLC常用于分析）反相层析原理：同疏水层析，常用于高效液相层析特点：①使用的固相支持剂颗粒很细（5um），表面积很大,因而分辨率很高。②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。固定相（柱填料）：常用