北师大生科细胞复苏与计数省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件.pptVIP

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细胞复苏及

细胞判别与计数

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什么是传代培养？细胞传代应注意哪些问题?

细胞胞传代培养目标是什么?

贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不一样?

怎样预计是否传代和传代方式?

细胞冻存应注意问题。

讨论

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试验目标

掌握细胞复苏基本方法

掌握用血球计数板进行细胞计数方法。

学习死活细胞判别方法

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一、细胞复苏

原理：是以一定复温速率将冻存培养物恢复到常温过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养器官都能够进行冻存，并在适当条件下复苏。

复苏细胞标准：快溶。使培养物能快速经过对细胞有损害－5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。

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细胞复苏操作步骤

准备一个茶缸或1000ml烧坏，

内装2/3杯40℃温水。

从液氮中取出冻存管、快速置

于温水中并不停搅动。使冻存

管中冻存物在1分钟之内融化。

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将冻存管放入离心管中800rpm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台中，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃掉冻存液，沉淀加4ml培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养。

细胞复苏后，第二天换液去除漂浮未贴壁细胞，细胞长满后传代。经传代一至二次后，细胞即可恢复正常状态。

另取9滴细胞悬液加入1滴0.4%台盼蓝染色,取80µl细胞液镜下观察活力。

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细胞计数方法：血球计数板和xxx。

血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm厚玻璃制成。计数室边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室容积为0.1mm3。所以，可依据在显微镜下观察到细胞数目，换算成单位体积中细胞数量。

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细胞计数与死细胞判别

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按以下方式计算细胞浓度：

细胞计数标准：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少许两个以上细胞按一个细胞计数，如超出10%说明消化不充分。

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试验步骤

检验记数板：在正式计数前，先用显微镜检验记数板计数室，看其是否沾有杂质或干枯菌体。若有污物，则需作以下几步清洗：

擦洗用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板计数室。

冲洗用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上水分

注意：勿用内火焰来烤干）最终用擦镜纸揩洁净。

镜检镜检清洗后计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞计数。

加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间空隙。

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计数：将加好样品记数板置于显微镜载物台中央，然后按以下步骤操作：

找计数室先在低倍显微镜下寻找计数板上大方格网位置。寻找时显微镜光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。

转高倍镜转至高倍镜后，适当调整光度，使细胞和计数室线条均清楚为止。然后将计数室一角中格移至视野中。

计数计算计数板四角大格内细胞数，压线者只计算左侧和上方，右和下不计算在内。

清洗计数完成后，记数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最终用擦镜纸揩洁净。

细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数X100%

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注意事项

加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。

镜下计数，有时偶然有两个以上细胞组成细胞团，应按单个细胞计算。

如细胞团占10%以上，说明消化不充分，

细胞数少于20个/平方毫米或多于50个/平方毫米时，均说明稀释不妥，需重新置备细胞悬液，再重新记数。

染色标本在15分钟内检验计数，因为台盼兰染液能够快速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。

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常见细胞污染判别

假如是细菌污染，应该很快培基就浑浊了，常见为显著或不显著成串状，生长很快，培养基很快变得似泥沙状混浊，黑点移动速度非常快。

假如是真菌感染，尤其是早期污染，在低倍镜下能够看到小黑点，尤其是成团小黑点，要尤其注意。假如无法确定，就换高倍镜，假如是死细胞或细胞碎片，高倍镜下就能够分辨，而真菌高倍镜下依然是小黑点。

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判别细胞污染方法

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惯用方法

基本操作

优缺点

连续培养观察法

把疑似培养物单独标示出来，继续培养，24或48小时后再进行大致和镜下观察，对比混浊度改变

优：稳妥、不轻易误判和漏判；

缺：耗时、轻易耽搁细胞换液或传代以及发放时机

取样培养或涂片法

经过无菌操作取出部分培养物进行菌培养，或取出进行革兰氏染色镜下识别

优：客观、能够识别一些污染类型，利于排查

缺：相对繁琐，易在操作中引入新污染、存在一定假阳性或假阴性

直接镜下识别法

利用高倍镜（400倍）对疑似污染培养物进行观察，从黑点分布、运动特征、外观形态综合判断

优：高效、无须对培养物进行额外