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仅需12步，助你做出完美免疫组化IHC片子

温故而知新

今天翘仔将梳理免疫组化（IHC）实验的12步经典操作，逐个击退

IHC实验道路上的“拦路虎”，让萌新打好基础，老手巩固知识，带

着满满的干货轻松愉快的搞定免疫组化。

IHC作为免疫学实验的“三件套”之一，广泛用于基础研究和临床病

理诊断。基础研究中，IHC可确定细胞内的抗原，及进行定位、定性

和定量分析。临床病理诊断，IHC可用于确定肿瘤的来源、分类和评

估预后效果。

老生常谈：什么是IHC？

做实验就要铭记原理，做到胸有成竹。简而言之，免疫组化IHC是利

用抗原抗体反应确定组织细胞内抗原，并通过染色实现可视化。

IHC实验原理

IHC是一种能让我们在组织切片中找到目的蛋白的超级强大技术。IHC

技术为我们打开了一扇窗，直接观察蛋白质在细胞和组织中的精准定

位。IHC看似简单，操作过程中却存在许多变量。每次开始实验之前，

我们都应该来一次“扪心自问”。

IHC实验必备

根据不同的染色步骤、标记物和结合方式，IHC染色方法多样，比较

常用的有间接法、酶标法、免疫荧光法等。

IHC实验分类

为了提高IHC检测的灵敏度和特异性，操作步骤不断更新换代，但最

主要的还是一抗的质量。义翘神州推出近百种病理验证免疫组化抗体，

均为高特异性单克隆抗体。为助力IHC研究，义翘神特推出抗体免费

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老生畅谈：怎么做IHC？

操作繁琐，

只需静下来慢下来，

慢慢阅读，

总会做出满意的结果！

石蜡切片的IHC实验一般包括12个步骤：取样、固定、包埋、切片、

脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、封

片观察。

1、取样

正取的组织取样是IHC成功的第一步。

操作关键点：

1）组织块要大小适中，一般为1.5*1.5*0.5cm3，过大会影响固定

液的渗透。

2）刀要快手要稳，取病理材料时勿挤压（防止组织变形）、勿刮抹

（以防缺损），避免机械损伤、化学损伤、组织风干等。

3）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水

或PBS进行冲洗，去除可能影响固定效果的物质；大体积组织可在固

定前适当切割，确保组织厚度小于0.5cm。

4）病变组织取材：若有肉眼可视病变，取准标本病变部位，切勿漏

取；若有肿瘤，包括肿瘤转移部位、切缘等全面描述病变状况，由表

及里观察病变状况测重量、记录部位和脏器重量。

5）根据实验方法、目的、病变等尽量多取材，选取的组织材料要包

括各脏器的主要结构。为了检查IHC实验流程的有效性和排除假阴性，

需要设置阳性组织对照，同样为了检查是否存在非特异性结合和去除

假阳性，需要阴性组织对照。

6）取材要及时，固定也要及时，建议组织取样后立即固定。

7）及时、准确的记录每一个组织的名称、种属、类型、取材时间、

临床信息、组织块数量等基本信息。

2、固定

目的：

防止组织细胞自溶与腐败，保存组织细胞的抗原不发生弥散和损失。

10%中性福尔马林固定是目前应用最广泛且效果较好的固定方式。

操作关键点：

1）根据抗原类型选择合适的固定液，如下表：

-固定液

组织切片：10%中性福尔马林

大多数蛋白质、肽和酶

细胞样本：4%多聚甲醛

大分子抗原（如免疫球蛋白）冰浴的丙酮或甲醇（100%）

氨基酸等小分子4%多聚甲醛

核酸Carnoy固定液

细胞核形态福尔马林-硫酸锌溶液

精细组织Bouin固定液

造血器官（如肝、脾、骨髓）Zenker固定液

2）确保组织完全浸入固定液中，固定液体积一般是组织的10-20倍。

3）组织离体后尽快固定，最理想是在几分钟内完成。

4）固定时间视组织类型和实验要求定，一般为室温6-48h。固定时

间不宜过长，防止组织过度硬化和抗原损失。

5）固定的容器要干净、无杂质，避免污染组织。