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T载体克隆的DNA序列分析

试验目的：了解常规DNA序列分析技术(Sanger双脱氧法)的原理及

操作步骤。

试验原理：

在分子生物学讨论中，DNA的序列分析是进一步讨论和改造目的基

因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)创造的双脱氧

链末端终止法和Maxam和Gilbert(1977)创造的化学降解法。两种方

法在原理上差异很大，但都是依据核苷酸在某一固定的点开头，随机

在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系

列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA

序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延长结合在待定

序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测

定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有全部四种脱氧核苷酸三

磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由

于ddNTP缺乏延长所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性

地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每

一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百