酶的分子修饰.ppt

第126页,共136页，星期六，2024年，5月步骤运用PCR技术构建核糖体展示文库：选择无细胞系系统进行体外转录和翻译,因为mRNA末端缺少终止密码子,核糖体停留在mRNA的末端而形成ARM复合体→通过特异性抗原或者标签的特异性结合进行筛选,筛选出与其有强特异性的mRNA→将所筛选出的有高亲和力的mRNA进行反转录为cDNA,并进行扩增→转化到载体,进行表达测定。通过这个流程可以进行多次筛选以提高所表达蛋白的特异性及亲和性。第127页,共136页，星期六，2024年，5月mRNA体外展示技术又称为mRNA-蛋白质融合体展示技术，是一种新兴的体外多肽筛选技术。化学合成编码多肽库的DNA库，并对DNA进行特殊加工，在5′端添加T7聚合酶启动子、翻译增强子、翻译起始密码子等序列；在3′端添加亲和纯化标签。在体外利用T7RNA聚合酶将DNA转录成RNA，把RNA的3′端和带有嘌呤霉素的连接子结合，带有嘌呤霉素连接子的诱饵RNA和RNA文库在无细胞系翻译体系中共翻译，通过嘌呤霉素的作用，mRNA与其所翻译的蛋白质结合起来形成mRNA-蛋白质融合体。从而实现了基因型(mRNA)和表型(蛋白质)的结合。第128页,共136页，星期六，2024年，5月一般利用翻译蛋白所带的亲和标签，用亲和层析技术将mRNA-蛋白质融合体纯化出来，并对mRNA进行反转录，生成cDNA-mRNA-蛋白质融合体.采用ELISA、磁珠法等，将筛选的靶物质固定化于固相载体上，含有目标蛋白的cDNA-mRNA-蛋白质融合体就能通过与固相载体上的靶物质特异性结合而得到分离.通过洗脱液将猎物cDNA-mRNA-蛋白质融合体洗脱下来，加酶分解得到cDNA，将其进行PCR，所得产物进入下一轮循环.经过多次循环，目标蛋白及其编码的基因序列最终得到富集和分离。第129页,共136页，星期六，2024年，5月第130页,共136页，星期六，2024年，5月嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质稳定的氨酰tRNA类似物。当3′端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA的3′端与多肽的羧基端共价结合起来。第131页,共136页，星期六，2024年，5月在核糖体展示技术中，先对编码蛋白的DNA进行特殊的加工与修饰，去掉3′端的终止密码子，使核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码而停留mRNA的3′末端不脱离，从而形成mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。核糖体展示技术的缺点就在于mRNA-核糖体-蛋白质的三元复合体缺乏稳定性。mRNA展示技术去掉了核糖体，将mRNA与其编码的蛋白质通过嘌呤霉素直接连接到一起，形成一个更简单更坚固的系统。第132页,共136页，星期六，2024年，5月5、环境文库的构建以及对于酶活性的功能筛选（1）从环境中获得标本及DNA的分离（2）环境中DNA文库的构建（3）环境文库的筛选（4）结论第133页,共136页，星期六，2024年，5月四、定向进化的应用和展望提高酶分子的催化活力热稳定性的分子进化适应人工环境的酶分子热稳定性或活性的分子进化新的底物特异性的酶的进化对映体立体选择的人工进化第134页,共136页，星期六，2024年，5月关键问题确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力。选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点。若用于理论研究，应控制较低的突变率建立有效且灵敏的筛选或选择方法。第135页,共136页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第136页,共136页，星期六，2024年，5月****2、突变体基因的构建策略（1）DNA随机酶切片段拼接（2）单链DNA随机拼接（3）限制性酶切片段随机拼接第94页,共136页，星期六，2024年，5月(1)DNA随机酶切片段连接将两个高度同源的基因经DNAaseI酶随机剪切得到大量的酶切片段，接着采取“无引物”PCR扩增法将同源片段随机重组，然后通过特异性引物PCR扩增全长基因。重组---扩增---筛选第95页,共136页，星期六，2024年，5月（2）单链DNA随机拼接单链DNA为模板链，以此制备片断化得DNA片段，然后进行同源片段随机拼接重组。第96页,共136页，星期六，2024年，5月（3）限制性酶切片段随机拼接采用特定的限制性酶切片段对DNA进行切割，产生的都是特异的限