缺陷假单胞菌.pdf

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缺陷假单胞菌（B.）ATCC19146菌种鉴定

1.菌落形态

TSA平板：微黄，光滑，边缘整齐。

2革兰氏染色

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2.1原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的

复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇

乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处

理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；

而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在

遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫

与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，

就使革兰氏阴性菌呈红色。

2.2实验步骤

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法

是：

1取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致

确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2涂片：

液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手

持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载

玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载

玻片上，使其薄而均匀。

3晾干：让涂片在空气中自然干燥。

4固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。

6水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观

察细胞形态。

7媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立

即水洗。

9复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。

2.3染色结果

革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

缺陷假单胞菌是革兰氏阴性菌

3．靛基质（Indole）试验

3.1原理

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出

来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

3.2试验方法

将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml

培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙

醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管

壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

缺陷假单胞菌为阴性结果

4．甲基红试验

4.1原理

某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，

产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则

呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转

化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，

故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。

4.2方法

挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C

（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2

滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍

为阴性、即可判定结果。

4.3结果

呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。

缺陷假单胞菌为阴性结果

5.V-P试验

培养基：含葡萄糖、K2HP