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临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验

酶免疫技术复习资料汇编

概念：酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应

的专一性相结合的一种免疫检测技术。既保留了抗体或抗原的免疫学

活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。可通过酶对底

物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提

高了抗原抗体反应的敏感性。

一、酶免疫技术的特点

既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活

性和生物放大作用。可通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行

定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。

（一）酶的要求

一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产

物，用酶标记抗体或抗原建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得

以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合下列要

求：

1.酶的活性要强，转化率高，纯度高。

2.易与抗体或抗原偶联，活性保持稳定。

3.作用专一性强，无内源性酶或抑制物。

4.易于判断或测量，方法简单、敏感和重复性好。

5.无害，易得。

（二）常用的酶

1.辣根过氧化物酶（HRP）；

HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白

（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性

基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸

收峰在275nm。HRP的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm和

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275nm处的吸光度比值来表示的。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应

大于3.0。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂

的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活

性无关。

2.碱性磷酸酶（AP）

AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但

两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最

适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的

活性高于前者。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）。

（三）常用的底物

1.邻苯二胺（OPD）：是ELISA中应用最早的底物，HRP的敏感底

物之一。在HRP的作用下显橙黄色，加强酸终止反应后呈棕黄色，最

大吸收峰在492nm波长。但稳定性差，易变色，具有致癌性。

2.四甲基联苯胺（TMB）：HRP新型底物。经HRP作用后变为蓝

色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。TMB

具有稳定性好，成色无需避光，无致突变作用等优点。缺点是水溶性

相对较差。

3.对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）：p-NPP经碱性磷酸酶作用后的产

物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

4.4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）：β-半乳糖苷酶（β

-Gal）的底物。酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞酮

（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。

（四）酶标记抗体或抗原

1.标记方法要求：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反

应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。

2.常用的标记方法有戊二醛交联法和改良过碘酸钠法两种。

3.常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200／G-150过柱层析纯化和

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