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罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书
(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)
一、原理：
TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒
是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其
原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移
酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的
3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）
的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）
反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细
胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的
细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本
试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细
胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗
肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂
器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱
布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试
剂：试剂盒含：
1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、
2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、
3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、
70%）、
DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μl
PBS）、
ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或
细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、
苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，
pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
三、实验步骤
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反
应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并
拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：
1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理
4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、
时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的
ProteinaseK（400μg/mL）处理5分钟。其它替代方法：石蜡切片
的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即
蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10min（通透液：
0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中
8-10min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HClPH2
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