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大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤--第1页

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增

殖和表达。研究发现，用含Ca2+的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源

DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的

状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2

法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处

于0°C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外

源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复

合物。宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和

甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素

的基因（AP＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些

含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质

粒。

本实验以E.coliJM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感

受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行

适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而

未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增

后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的

制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂

1.仪器：

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度

计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2.材料

E.coliJM109受体菌、质粒pUC18。

3.试剂：

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LB培养液（1L）：

胰蛋白胨10g

酵母粉5g

NaCl10g（高盐）或5g（低盐）

氨苄青霉素（Ampicillin）100mg/ml

在三角瓶中将胰蛋白胨10g，酵母粉5g以及NaCl5g溶于1L的重蒸水

中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml100mg/ml的氨苄青霉

素。然后贮存于4℃备用。

LB平板培养基：

胰蛋白胨10g

酵母粉5g

NaCl10g或5g，

琼脂13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温

至50℃，取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液

中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。

90mm直径的培养皿约需30～50ml培养基。培养基完全凝结后，倒置平皿并贮

存于4℃备用。

其它试剂：0.1MCaCl2溶液、灭菌蒸馏水

三、操作步骤