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遗传病的分析3

人类淋巴细胞培养

和染色体标本的制备

原理

§在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、

大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研

究。

§因此利用人工的方法，使大局部分裂细胞处

于中期而不向后期转化，并获得之，经处理，

制片后观察分析。

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器材与试剂

器材

§人外周血5ml。

§培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天

平等。

§试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰

载玻片等。

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器材与试剂

§试剂：

§肝素

§含10%小牛血清RPMI1640

§植物血凝素〔PHA〕

§秋水仙素〔5微克/毫升〕

§0.075MKCl，

§固定液〔甲醇/冰乙酸3:1〕

§Giemsa染液。

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操作

1、采血：取血3-5ml,肝素抗凝。

2、接种：5ml培养液中参加0.3-0.5ml

并摇匀，每份血样接种2瓶，置37℃,培养

72h。

3、秋水仙素处理：终止培养前1.5-2h加秋

仙素〔终浓度为0.07ug/ml〕，混匀，37℃

继续培养。

4、收集细胞：将培养细胞混匀吸入刻度离

心管〔2瓶培养物吸入1支刻度离心管内〕，

1500r/min离心，10min。

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操作

6、预固定：低渗处理后，加1ml固定液混

匀，5min后1500r/min离心，10min。

7、固定：弃上清，加8ml固定液，混匀，

室温静置30min，1500r/min离心，10min。

8、再固定：同上〔省略〕。

9、制备细胞悬液：弃上清，视细胞数量多

少加适量固定液制成细胞悬液。

10、制片：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻上，

并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。

11、观察：Giemsa染色，5min，自来水冲洗，

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结果

光镜100倍下人染色体G带照片

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本卷须知

§培养温度应严格控制在37℃±0.5℃。

§培养液的pH值7.4±0.1，偏酸细胞发育不良，偏

碱那么细胞出现轻度固缩。

§PHA的质量和浓度很关键，它对淋巴细胞的刺激效

应有个体差异较大。〔肝素〕

§秋水仙素一般最终浓度以0.04-0.08ug为宜，处理

时间为1-4h。

§低渗的浓度与时间应掌握好。

§固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。

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