组织学基本技术.ppt

抗体保存：浓缩液于-80℃可保存三年左右。购买后，应在无菌条件下，将抗体分装成小包装，蜡膜密封。禁忌反复冻融。选择最佳抗体稀释度：抗体稀释液用山羊血清、BSA或脱脂奶粉等。抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴50ul为好。选择合适的孵育时间：4℃孵育过夜，室温2小时，37℃30-60分钟。抗体使用注意事项第63页,共69页，星期六，2024年，5月必须设染色对照：每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确的判断。抗原表达必须在特定部位：阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞膜、胞核。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。5.免疫组化结果的判断原则第64页,共69页，星期六，2024年，5月阴性结果不能视为抗原不表达：即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准：当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。第65页,共69页，星期六，2024年，5月所用的抗体特异性差，与其它无关的抗原有交叉反应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。抗体浓度过高或染色过程中切片干燥，导致抗体与组织产生非特异性结合。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。实验操作不当：边缘效应；切片脱蜡不彻底；PBS冲洗不彻底；底物显色时间过长等。假阳性出现的原因第66页,共69页，星期六，2024年，5月抗体已失活、浓度过低；组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本。组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。实验操作不当：固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。一抗孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确假阴性出现的原因第67页,共69页，星期六，2024年，5月五、组织学的学习方法注意结构与功能的联系建立立体与动态的概念重视理论与实践的结合第68页,共69页，星期六，2024年，5月*感谢大家观看第69页,共69页，星期六，2024年，5月****固定方法浸透固定：将组织切成小块，直接投入固定液中固定。灌注固定：一般采用心脏灌注固定。固定更加迅速、均匀。尤其适用神经组织。第31页,共69页，星期六，2024年，5月固定注意事项及时固定：最好动物死后半小时内固定，一般不超过2小时。固定液选择：根据组织的特点、染色方法选择合适的固定液。固定液的量：一般为组织体积的6-10倍。固定时间：在保存组织形态结构的同时，尽可能较好保存组织细胞的抗原。固定温度：低温可以保持好的结构。第32页,共69页，星期六，2024年，5月高效、方便、快捷的全自动形态检测平台！第33页,共69页，星期六，2024年，5月（三）染色HE染色（hematoxylin-eosinstaining）：组织学最常用的染色方法。特殊染色：硝酸银染色、醛复红染色、甲苯胺蓝染色等。第34页,共69页，星期六，2024年，5月镀银染色神经元H.E染色第35页,共69页，星期六，2024年，5月苏木精碱性染料将嗜碱性物质染成蓝色酸性染料将嗜酸性物质染成红色细胞核中的染色质细胞质中的核糖体多数细胞的细胞质（线粒体、溶酶体、滑面内质网）HE染色嗜碱性嗜酸性伊红第36页,共69页，星期六，2024年，5月细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20℃保存。第37页,共69页，星期六，2024年，5月细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。第38页,共69页，星期六，2024年，5月组织化学技术概念：应用化学反应或免疫学反应等原理检测组织和细胞的化学成分并进行定位、定量的技术。