细胞融合与单克隆抗体.ppt

*柠檬柚，甜瓜是香瓜和哈密瓜的杂交**神经氨酸酶降解细胞膜糖蛋白*细胞融合前的准备（2）制备饲养细胞（feedercell）：小鼠腹腔巨噬细胞，能分泌生长因子促使单个细胞容易生长，还能清除死亡破碎细胞及微生物。于细胞融合前一天，取SPF级健康Balb/c小鼠，处死，用75%酒精浸泡10min，消毒小鼠体表。将其移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用无菌注射器吸取10ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球轻揉腹部2～3min；用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，吸出腹腔液，放入10ml离心管，1000rpm，离心10min，弃上清；第31页,共59页，星期六，2024年，5月用5mlHAT培养基重悬细胞，计数调整细胞数1×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。一般一只小鼠可获得5×106～8×106个饲养细胞，用于3块96孔板融合细胞培养。第32页,共59页，星期六，2024年，5月细胞融合前的准备（3）骨髓瘤细胞悬液的制备：细胞融合前两周复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，待细胞生长稳定后，以终浓度为20μg/mL8-AZ完全培养液培养两周，筛选HGPRT缺陷型细胞。融合前48h将SP2/0细胞进行传代培养，选取对数生长期的细胞，于融合前用新鲜培养液换液一次，融合当天收集细胞悬液，离心弃上清，用1640液洗涤一次，重悬于培养液中，计数细胞总数。第33页,共59页，星期六，2024年，5月细胞融合前的准备（4）免疫鼠脾细胞悬液的制备：处死一只免疫好的Balb/C小鼠，小鼠用75%酒精浸泡10min；无菌操作取出脾脏，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织。然后换一新玻璃皿，加入1640液30ml，将脾脏置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，期间用不完全培养基冲洗数次，使脾细胞穿过网孔进入溶液中；第34页,共59页，星期六，2024年，5月将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，1000rpm，去上清，用不完全培养基10ml洗涤细胞3次，离心收集脾细胞；将脾细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，计数，置室温待用。第35页,共59页，星期六，2024年，5月细胞融合融合前将50%PEG置于37℃培养箱中预温；吸取SP2/0细胞悬液和脾细胞悬液至一个50ml离心管中，使脾细胞∶骨髓瘤细胞=10∶1，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清；吸取0.7ml50%PEG，离管底约2cm处沿管壁加入PEG，1min左右加完，静置90s；逐滴加入37℃预温的不完全培养基1ml，再吸取不完全培养基10ml，缓慢加入，最后加入20ml不完全培养基；第36页,共59页，星期六，2024年，5月800rpm，离心8min，弃去上清，加入HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀；将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μl；每块培养板留3~5孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养。第37页,共59页，星期六，2024年，5月PEG介导细胞融合的机制第38页,共59页，星期六，2024年，5月提高融合率的技术措施饲养细胞的加入有助于促进杂交瘤细胞的生长。PEG浓度要准确：PEG在50～60℃时仍为液体状态，含DMSO的1640液要保温50℃，两种液体混合时一定要充分混匀；当脾细胞和瘤融合时，末次离心后应尽量吸出上清，可避免对PEG的稀释作用；由于PEG能引起蛋白质的沉淀，故脾细胞、瘤细胞需经不含小牛血清的1640液的洗涤。第39页,共59页，星期六，2024年，5月PEG作用瘤细胞和脾细胞融合后，加入无血清1640液时要控制好速度，否则当渗入的液体太快，细胞可能胀破；融合后离心速度不要太高，一般为800rpm，5min。细胞融合时，脾细胞∶骨髓瘤细胞的比例一般为5～10∶1，每孔接种的细胞大约为1×105～2×105，接种过多，容易在单孔内形成多个克隆集落，不利于克隆化操作。第40页,共59页，星期六，2024年，5月杂交瘤细胞的筛选：HAT培养基融合后每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并于第5天每孔半量换液HAT培养基100μl。第41页,共59页，星期六，2024年，5月杂交瘤细胞融合情况观察4d10d9d7d5d第42页,共59页，星期六，2024年，5月抗体特异性筛选：融合后10天～14天，细胞克隆长至孔底的1/3～1/2时，即可采用