非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范.docx

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非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范

1范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒（ASFV），英文缩略表见附录D，核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测技术的要求。

本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。

4试剂或材料

除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。

4.1水：GB/T6682，一级水。

4.21×PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.1。

4.3核酸提取试剂：

a)蛋白酶K溶液（20mg/mL）：配制见附录A.2；

b)10%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.3；

c)Tris平衡酚；

d)三氯甲烷；

e)70%乙醇：配制见附录A.4。

4.4重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。

4.5DEPC水。

4.6恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附录B.1。

4.7无水乙醇。

4.8微量移液器配套的带滤芯吸头。

4.9离心管：1.5mL。

5主要仪器设备

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5.1微量移液器：最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL。

5.2生物安全柜。

5.3普通冰箱。

5.4涡旋振荡器。

5.5研磨管。

5.6荧光定量PCR仪：Peltier加热，≥16孔（0.2mL，2×8联管和单管）。

5.7电子天平：感量为0.001g。

5.8低温高速台式离心机：离心力≥8000g。

6样品

6.1基本要求

应符合GB19489—2008和NY/T541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。

6.2样品采集

6.2.1棉拭子样品

无菌操作，采集猪口腔拭子。

6.2.2组织样品

无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2℃~8℃低温运至实验室。

6.2.3环境样品

相关场所的粪便、饲料、污水样品。2℃~8℃低温运至实验室。

6.3样品处理

6.3.1口腔拭子样品处理

口腔拭子管6000r/min震荡45s，取200μL进行核酸提取。

6.3.2脾、肺、肾等组织样品处理

取0.05g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45s，制成约10%的组织匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。

6.3.3粪便、饲料样品处理

取1g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45s，制成约10%的匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。

6.3.4污水样品处理

取200μL污水进行核酸提取。

7操作步骤

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7.1取6.2处理

后的样品500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/mL蛋白酶K溶液10μL，于55℃水浴2h～3h。7.2加入200μLTris平衡酚，混匀，4℃12000g离心15min。

7.3取上清液500μL，加入200μLTris平衡酚和200μL三氯甲烷，4℃12000g离心15min。7.4取上清液400μL，加入200μL三氯甲烷，4℃12000g离心15min。

7.5取上清液300μL，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，4℃12000g离心15min。7.6弃上清液，加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

7.7加入20μL灭菌一级水溶解沉淀，-20℃保存备用。

7.8也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取。

7.9设50μL反应体系，详见附录B.2。

7.10每次反应设置试验中同时质粒DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附录B.3。

8结果判定

8.1结果判读见表1。

表1结果判定

序号

通道