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非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范
1范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒(ASFV),英文缩略表见附录D,核酸的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测技术的要求。
本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA,依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合,使模板处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交,然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。
4试剂或材料
除非另有规定,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。
4.1水:GB/T6682,一级水。
4.21×PBS溶液(pH值7.4):配制见附录A.1。
4.3核酸提取试剂:
a)蛋白酶K溶液(20mg/mL):配制见附录A.2;
b)10%十二烷基硫酸钠(SDS溶液,pH7.2):配制见附录A.3;
c)Tris平衡酚;
d)三氯甲烷;
e)70%乙醇:配制见附录A.4。
4.4重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。
4.5DEPC水。
4.6恒温扩增检测的引物:恒温扩增检测引物见附录B.1。
4.7无水乙醇。
4.8微量移液器配套的带滤芯吸头。
4.9离心管:1.5mL。
5主要仪器设备
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5.1微量移液器:最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL。
5.2生物安全柜。
5.3普通冰箱。
5.4涡旋振荡器。
5.5研磨管。
5.6荧光定量PCR仪:Peltier加热,≥16孔(0.2mL,2×8联管和单管)。
5.7电子天平:感量为0.001g。
5.8低温高速台式离心机:离心力≥8000g。
6样品
6.1基本要求
应符合GB19489—2008和NY/T541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。
6.2样品采集
6.2.1棉拭子样品
无菌操作,采集猪口腔拭子。
6.2.2组织样品
无菌操作,取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2℃~8℃低温运至实验室。
6.2.3环境样品
相关场所的粪便、饲料、污水样品。2℃~8℃低温运至实验室。
6.3样品处理
6.3.1口腔拭子样品处理
口腔拭子管6000r/min震荡45s,取200μL进行核酸提取。
6.3.2脾、肺、肾等组织样品处理
取0.05g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中,6000r/min震荡研磨45s,制成约10%的组织匀浆液,5000g离心5min,取200μL上清液进行核酸提取。
6.3.3粪便、饲料样品处理
取1g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中,6000r/min震荡研磨45s,制成约10%的匀浆液,5000g离心5min,取200μL上清液进行核酸提取。
6.3.4污水样品处理
取200μL污水进行核酸提取。
7操作步骤
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7.1取6.2处理
后的样品500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/mL蛋白酶K溶液10μL,于55℃水浴2h~3h。7.2加入200μLTris平衡酚,混匀,4℃12000g离心15min。
7.3取上清液500μL,加入200μLTris平衡酚和200μL三氯甲烷,4℃12000g离心15min。7.4取上清液400μL,加入200μL三氯甲烷,4℃12000g离心15min。
7.5取上清液300μL,加入2倍体积的无水乙醇,-20℃静置20min,4℃12000g离心15min。7.6弃上清液,加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁,弃乙醇,晾干。
7.7加入20μL灭菌一级水溶解沉淀,-20℃保存备用。
7.8也可选择市售商品化DNA提取试剂盒,完成DNA的提取。
7.9设50μL反应体系,详见附录B.2。
7.10每次反应设置试验中同时质粒DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附录B.3。
8结果判定
8.1结果判读见表1。
表1结果判定
序号
通道
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