细胞分离技术.ppt

*2、凝胶过滤复性技术凝胶通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离，从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性。3、反胶束萃取复性法第63页,共65页，星期六，2024年，5月*总结常用细胞分离方法有哪些？并说明其原理。什么是细胞破碎和细胞破碎率？细胞破碎的方法主要有哪些？其原理各是什么?什么是包含体？包含体形成的原因有哪些？包含体的溶解常用的试剂有哪些？蛋白质复性常用的方法有哪些?第64页,共65页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第65页,共65页，星期六，2024年，5月*三、细胞破碎的方法破碎方法机械法非机械法固体剪切作用液体剪切作用珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法第31页,共65页，星期六，2024年，5月*1）珠磨法（图3-6）作用机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。第32页,共65页，星期六，2024年，5月*影响因素：①转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。②细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。③珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。第33页,共65页，星期六，2024年，5月*④温度：将温度控制在5～40℃对破碎物影响较小。⑤流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。第34页,共65页，星期六，2024年，5月*温控与能耗珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内；珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比；高的破碎率会提高分离的成本。第35页,共65页，星期六，2024年，5月*2)高压匀浆法（图3-8）作用机理从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。第36页,共65页，星期六，2024年，5月*温控与能耗活性物质在破碎过程中的失活问题。蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35oC以下，酶失活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。机械破碎的能耗主要包括提供动力消耗的能量及低温操作消耗的能量。第37页,共65页，星期六，2024年，5月*3)超声波法作用机理声频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。第38页,共65页，星期六，2024年，5月*此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎；因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施；另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。第39页,共65页，星期六，2024年，5月*超声波破碎过程效率的影响因素：①声频②声能③处理时间④细胞浓度⑤菌种类型第40页,共65页，星期六，2024年，5月*四)化学渗透法用化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。作用机理化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。第41页,共65页，星期六，2024年，5月*有机溶剂（苯、甲苯）表面活性剂有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）表面活性剂处理法使细胞膜破坏。金属螯合剂（EDTA）变性剂（盐酸胍、脲）第42页,共65页，星期六，2024年，5月*五)酶溶法用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、?-1，3-葡聚糖酶、?-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。第43页,共65页，星期六，2024年，5月*作用机理溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。第44页,共65页，星期六，2024年，5月*酶溶法的优点：①产品释放的选择性高②抽提的速率和收率高③产品的破坏最少④对pH和温度等外界条件要求低⑤不残留细胞碎片第45页,共65页，星期六，2024年，5月*六)物理法①渗透压冲击法②反复冻融法多用于动物细胞。将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解