滇金丝猴检疫技术 第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

滇金丝猴检疫技术

第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范

重要提示：本文件涉及人兽共患病原体的操作，应在符合国家相关生物安全规定（GB19489和NY/T541）的条件下进行。

1范围

本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）检疫技术中隐孢子虫实验室检测技术的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理。

本文件适用于滇金丝猴检疫技术中隐孢子虫实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

隐孢子虫Cryptosporidium

顶复门孢子虫纲真球虫目隐孢子虫科隐孢子虫属。主要寄生于动物的肠上皮细胞，可引起隐孢子虫病。隐孢子虫卵囊是其感染阶段，卵囊圆形或椭圆形，直径4μm～6μm，囊壁光滑、无色，一个卵囊中含有4个子孢子。目前共鉴定出9个隐孢子虫种可以感染非人灵长类动物。其中，微小隐孢子虫（C.parvum）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）感染较普遍。

3.2

巢式PCRNestedpolymerasechainreaction

利用2套引物，对靶细胞基因2次识别并进行2轮扩增的方法。它可从极少量的模板中获得较高浓度和纯度的靶片段，第1次扩增反应的产物被用作第2次PCR的模板，而第2次反应的寡核苷酸引物对位于第1对引物内侧。

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4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对Basepair

dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合液DeoxyribonucleosidetriphosphatesmixtureDNA：脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

PCR：聚合酶链式反应Polymerasechainreaction

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液Trisacetate-EDTAbuffer

BLAST：基于局部序列比对算法的搜索工具Basiclocalalignmentsearchtool

5试验原理

隐孢子虫卵囊没有孢子囊，有4个子孢子，该形态特征与其他孢子虫的卵囊明显不同。依据该特征可进行隐孢子虫的形态分类学鉴定。对于形态学鉴定存疑的物种，采用分子生物学方法进一步确定。

6试验条件

6.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489中生物安全实验室的要求。

6.2采样人员要求

采样人员应为与动物保护相关的专业技术人员。采样过程中的生物安全要求应符合GB/T27401的要求。

7仪器设备和试剂

7.1仪器设备

7.1.1微量移液器：10μL、50μL、200μL、1000μL，微量移液器枪头若干。7.1.2振荡器。

7.1.3正置光学显微镜。

7.1.4载玻片及盖玻片若干。

7.1.5落地式低速离心机：3000r/min。

7.1.6玻璃棒、接种环、烧杯（或塑料杯）、金属筛（40目）、离心管。7.1.7电子天平：感量为0.001g。

7.1.8高速台式离心机：12000r/min。

7.1.9恒温水浴锅：36℃±1℃,65℃±1℃。7.1.10PCR扩增仪。

7.1.11电泳系统。

7.1.12微波炉。

7.1.13凝胶成像系统。

7.2试剂

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7.2.1商品化DNA提取试剂盒。

7.2.2商品化PCR分子扩增使用试剂，包含有dNTP、10×buffer(mg2+free)、Mg2+、rTaq酶。

7.2.3DL2000DNAMarker。

7.2.4琼脂糖粉。

7.2.5电泳缓冲液。

7.2.6商品化核酸染料。

7.2.76倍上样缓冲液（6×LoadingBuffer）。

7.2.8引物：基于隐孢子虫核糖体小亚基RNA基因（SSUrRNA）设计引物。

7.2.9饱和蔗糖水溶液：蔗糖1280g，蒸馏水1000mL，5%石碳酸21mL。

7.2.10抗酸染色液：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95％酒精20mL，5％石炭酸8mL，蒸馏水100mL；10％硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10mL，